恶性肿瘤是当前全球面临的重大健康问题之一,其发病率和死亡率一直居高不下。常用治疗肿瘤的方法有手术、放疗、化疗、基因治疗和光学疗法等[1]。采用化学或基因药物抑制肿瘤细胞的方法具有创伤性小和治愈率高的优势而成为肿瘤治疗的主要手段[2]。无论是化学药物还是基因药物,在使用时均需通过血液循环分布于全身或肿瘤组织,这就存在两个问题：一是药物在生理环境中的稳定性不足,进入血液后易被各种酶所降解,降低了可利用度；二是由于药物难以区分肿瘤细胞和正常细胞,使真正进入肿瘤细胞的药量有限,不仅影响肿瘤的疗效,也会对患者造成很大的毒副作用[3]。
靶向药物递送系统的出现为克服上述局限性提供新思路[4-5]。它通常由纳米药物载体、靶向组分和抗肿瘤药物三部分组成,其目标是在恰当的时机将适量的药物递送到肿瘤部位,从而增加药物的利用效率,提高疗效的同时减少毒副作用。其中,药物载体的选择是制备靶向药物递送系统的核心。常用的药物载体(如脂质载体、聚合物纳米球等)尽管具有生物相容性好和稳定性高的优势,但也存在制备过程中形貌和结构控制非常困难,包裹药物易泄漏等问题[6]。相较之下,无机纳米粒子(如金属纳米粒子、硅纳米粒子和纳米碳颗粒等)不仅具有制备工艺简单和结构易于控制的优势,而且表面易于官能化修饰,有利于药物的控释输送,成为药物载体的理想材料[7-8]。
零维纳米碳材料,如富勒烯、洋葱碳、碳点和碳球等,具备独特的零维结构便于其在生理环境中的循环代谢,在药物载体的应用领域中明显优于一维的碳纳米管和二维的石墨烯材料[9-12],示意图如图1所示。除了良好的化学性能和热稳定性外,零维纳米碳材料还具有高比表面积以及表面丰富的键合位,使其容易进行氨基、羧基的修饰,既能与药物分子结合,还能与特异性靶向分子相结合,可以更好地控制药物的扩散,进而达到药物靶向递送的目的。同时,具有优异光学特性的零维纳米碳材料可以应用于肿瘤的诊疗一体化,实现治疗与监测的同步[13-14]。总的来说,零维纳米碳材料是一种非常优秀的药物载体材料,在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。
图1 零维纳米碳基靶向药物递送系统的构建及其在肿瘤治疗中的应用
Fig.1 Construction of zero-dimensional carbon nanomaterial-based targeting drug delivery system and its application in tumor therapy
因此,本文对近年来应用于肿瘤靶向治疗的零维纳米碳材料药物递送系统进行综述与总结。首先根据碳球结构的不同对其进行分类,并对其一般制备方法加以概述,其次从靶向功能化修饰和药物担载两个方面对纳米碳基靶向药物递送系统的构建进行详细介绍。最后,对其在肿瘤化疗、基因治疗以及诊疗一体化中的应用总结概括,为其在生物医学中的应用提供可借鉴的理论与实践经验。
1 零维纳米碳基药物载体
零维纳米碳基药物载体根据尺寸以及石墨化程度的大小可以分为富勒烯、洋葱碳、碳点和碳球等。其中,富勒烯具有封闭的石墨层结构,直径在2～20 nm 之间；洋葱碳是以C60为核心的同心多层球面套叠结构的纳米碳材料,其尺寸通常在3～60 nm 之间；碳点的尺寸一般小于10 nm,而碳球的直径在50 nm～1μm 之间。这些零维纳米碳材料在靶向药物递送系统中有着广泛的应用[9-12]。
1.1 富勒烯
富勒烯是由不同数目碳原子组成的具有封闭结构的原子团簇,内部为中空结构,多为球型[15]。根据碳原子总数的不同,富勒烯可以分为C20、C60、C70、C76和C80等。其中,C60高度对称的笼状结构使其具有较高的稳定性,在富勒烯家族中研究也最为广泛。作为药物载体,富勒烯具有如下优势：1)较小的尺寸使其可以直接穿透细胞膜；2) 结构中有丰富的双键,容易进行多个官能团的同时修饰改性,从而增加药物的担载量；3) 独特的碳笼结构使其容易被制成微球、微囊、纳米粒、脂质体等用于药物或基因的可控递送[16]。
目前,较为成熟的富勒烯制备方法主要有电弧放电法、化学气相沉积法和火焰法等[17]。然而,上述方法制备的富勒烯只能溶于有机溶剂,在水中的溶解度非常低。为了更好地将富勒烯应用于生物体系,采用亲水聚合物包覆或亲水性基团的表面修饰,制备水溶性富勒烯,探索其在药物递送中的研究。除了实验工作的开展,分子模拟等理论方法也不断地被用于研究富勒烯作为药物载体的可行性[18]。研究者们尝试建立不同的富勒烯模型,研究其对药物分子的担载和递送作用。如图2 所示,C60-过渡金属卟啉衍生物(铁、钴和镍)和布洛芬(Ibp)(图2(a))[19],羧基富勒烯与COVID-19治疗药物莫努匹拉韦(图2(b))[20],氮化硼富勒烯与阿霉素(DOX)(图2(c))以及碱金属修饰的C60[21]和5-氟尿嘧啶(5FU)(图2(d))[22]等,为富勒烯药物递送系统的研究提供充分的研究基础。
图2 不同富勒烯结构与药物分子的结合模型优化
Fig.2 Optimized molecular structures of different C60mo and drugs
1.2 洋葱碳
洋葱碳是由若干层以C60为核心的同心石墨球壳层组成的纳米碳球体,因其层层包裹的结构类似洋葱而得名,其性能及应用如图3(a),3(b)所示。它具有独特的零维和中空结构,内部sp2杂化碳的错层壳内有序程度不同,表面具有丰富的官能团,非常有利于药物的担载[23]。此外,洋葱碳可以穿过血脑屏障实现药物的有效递送[24]。PAKHIRA et al[25]首先采用木棉的热解制备了洋葱碳,并通过硝酸处理使其尺寸约为15 nm,在小鼠模型中研究了洋葱碳穿过血脑屏障的情况。结果发现,随着注射时间的推移对体内大脑进行成像,可观察到洋葱碳顺利穿过血脑屏障。
图3 (a)洋葱碳在药物递送系统中的应用[24],(b)洋葱碳的透射电子显微镜像(TEM)[26],(c)碳点的结构示意图[28],(d)碳点的TEM 图像[31],(e)碳点药物递送系统的构建策略[35],(f)碳球的扫描电子显微镜像[36],(g)有序介孔碳球的TEM 图像[38]和(h)磁性碳球的TEM 图像[39]
Fig.3 (a)Application of carbon onion in drug delivery systems[24], (b)TEM image of carbon onion[26], (c)schematic diagram of carbon dots[28], (d)TEM image of carbon dots[31], (e)construction of carbon dots drug delivery systems[35], (f)scanning electron microscopy image of carbon nanospheres[36], (g)TEM image of ordered mesoporous carbon nanospheres[38],and(h)TEM image of magnetic carbon nanospheres[39]
已有多种物理化学方法用于合成洋葱碳,包括电弧放电法、化学气相沉积法、电子束辐射法、纳米金刚石热退火法、射频等离子体法、激光烧蚀法、高能球磨法和炸药爆轰法等[26]。这些制备条件通常比较严苛,且洋葱碳产量低。除了人工合成,陈义林等从自然界煤炭资源中发现了天然洋葱碳,外径范围在24～55 nm 之间,为其在生物医学领域中的应用提供了充足的原料基础[27]。
1.3 碳点
碳点是一种粒径小于10 nm,表面富含多种官能团的纳米碳颗粒,具有表面易功能化、良好的生物相容性、低毒性等优点。碳点通常由碳核和表面态组成,其中碳核是骨架,主要由sp2和sp3杂化碳构成,表面态则由大量含氧或氮基官能团组成,如图3(c)所示。根据碳核微观结构的不同,碳点可分为石墨烯量子点、碳量子点、碳纳米点和碳化聚合物点等[28]。不同碳点结构中的sp2和sp3也为π-π堆积方式装载芳香结构的药物提供可能性,作为一种新兴的药物载体展现出潜在的应用价值。与此同时,碳点具有优异的发光性能,在生物成像等领域具有较好的应用前景。因此,以碳点为药物载体和成像试剂,担载药物并构建荧光纳米药物递送系统如图3(d-e),应用于肿瘤的靶向治疗和荧光成像监测,为推动纳米材料在生物医药材料领域的发展具有重要的研究意义[29-33]。
碳点的制备方法从整体上分为两类：“自上而下”和“自下而上”。前者采用切割、剥离、球磨等物理方法或强酸氧化、热解和化学等化学方法破坏大分子(如碳纤维、石墨、石墨烯和活性炭等结构)得到碳点。后者则是利用小分子前驱体,如柠檬酸、糖类和有机生物质等,在水热或微波等条件下,发生聚合,进而碳化得到碳点[34-35]。前者的优势在于得到的产物表面含有官能团,不必表面修饰即可获得良好的溶剂分散性和较好的荧光性能；不足是反应副产物多,产物纯化困难。后者的优势在于操作简便、副产物少、可重复性强等,不足则是得到的碳点产量少且荧光量子产率偏低。
1.4 碳球
根据碳球结构的不同可分为实心碳球、空心碳球、多孔碳球、有序介孔碳球和磁性碳球等,如图3(f-h)[36-40]所示。由于其良好的生物相容性、化学稳定性、热稳定性和高比表面积等优点成为药物载体的研究热点。一方面,碳球在生物体内的药物传输过程中表现出优良的运输作用和代谢作用,且已经实现不同粒径的可控制备；另一方面,多孔结构的特征赋予材料超高的孔隙率,使其与原子、离子、分子乃至更大客体之间的相互作用不仅仅局限于外表面,更重要的是贯穿整个材料内部,可以将药物分子吸附并储存到孔道结构中,极大地增加药物分子的担载量；同时,碳球表面具有丰富的键合位,易于进行氨基、羧基或巯基修饰,可以更有效地控制药物扩散动力学[41]。因此,碳球是一种非常优秀的药物载体材料,在药物缓释体系的研究方面具有很好的应用前景。
碳球通常采用化学气相沉积法、水热或溶剂热法合成,进一步可以进行磁性或环境响应性等功能化的修饰,使其具有磁靶向的作用,或者可以对温度、p H 值、光等环境刺激的微小变化作出响应,从而实现药物的靶向控制释放。具体为药物分子加载到载体上之后,表面修饰后的响应性分子片段处于“关闭”的状态,阻止药物分子从孔道中扩散；而在肿瘤微环境的作用下,呈“打开”状态,定时定点地释放孔道中的药物分子,实现药物载体的载药和释药能力的平衡[42]。
以上四种零维纳米碳材料在药物递送过程中各有利弊。富勒烯和洋葱碳的合成条件较为苛刻,一方面产物的纯度得不到保证,另一方面其表面多呈疏水特性,在生物环境中需要进一步的改性应用,但是其小尺寸效应有利于其循环代谢,提升生物相容性。碳点由于其合成条件简单可行,且在水热制备环境中很好地遗传了原料的丰富官能团特性,非常便于载药,不足之处是碳点的产量偏低。尽管碳球的多孔结构赋予其优异的载药能力,但其尺寸偏大,易于团聚,导致其在生理环境对药物的递送有所受阻。
2 纳米碳基靶向药物递送系统的构建
靶向药物递送系统能够在空间、时间及剂量上全面综合调控药物在人体内的分布,可在恰当的时机瞄准病变部位,将适量的药物递送到正确的位置,实现可控的释放；同时增加药物利用率,提高疗效,减少毒副作用,从而获得更精准的治疗效果。可见,实现对药物的靶向输运和可控释放是纳米碳基靶向药物递送系统应具备的首要性质,当前的研究主要从纳米碳材料的靶向功能化修饰和药物的担载两方面展开。
2.1 靶向功能化修饰
为了缩短药物在血液中的循环时间,避免漏药现象出现,设计可以直接抵达肿瘤组织,或者通过特异性快速识别肿瘤组织的药物递送系统非常有必要。目前,靶向药物递送主要通过被动和主动靶向两种策略实现。
2.1.1 被动靶向
利用磁靶向或纳米材料在肿瘤组织的增强渗透与滞留效应(EPR)是最为常见的被动靶向作用[43]。
磁靶向纳米碳药物递送系统多以磁性碳纳米球为载体,将药物吸附在其外部高分子层或偶联在表面,通过口服或静脉注射注入体内,利用外加磁场引导药物载体到达特定的生理部位、器官或组织等病患处,在靶组织区域富集并缓慢释放从而发挥药物治疗作用[40]。LI et al[39]以Fe2O3为铁源、葡萄糖为碳源,水热法结合退火处理合成一种具有高比表面积、大孔容和磁饱和强度为30.16 emu/g的磁性多孔碳纳米球,其对药物模板分子亚甲基蓝的担载量为56.44 mg/g。CHEN et al[44]以苯酚和甲醛为原料、Fe2O3为催化剂、F127为软模板剂,软模板水热法结合退火处理合成有序介孔碳纳米球,然后在Fe(NO3)3·9H2O 存在下采用浸渍法合成磁饱和强度为11.93 emu/g的磁性有序介孔碳纳米球,其对化疗药物DOX 的载药量为284.7 mg/g[44].两种纳米碳球良好的磁性都赋予其优异的磁靶向药物递送作用。
在EPR 被动靶向研究中,LAPIN et al[45]研究了富勒烯C60衍生物纳米颗粒(C60-ser)的靶向性。在免疫小鼠模型的血管动力学研究中发现,由于C60-ser的体积小,可借助EPR 效应在肿瘤组织中聚集。与较大的纳米材料类似,C60-ser表现出快速的肿瘤血管系统外渗。对瘤内血管清除率的进一步分析表明,与70 k Da血管示踪剂相比,C60-ser被动靶向至肿瘤组织血管的效率增加。BAO et al[46]研究了一种新型硫氮共掺杂近红外发射碳点(NIRCDs)的EPR 靶向作用。向H22肿瘤小鼠静脉注射NIR-CDs后,小鼠全身逐渐表现出较强的近红外荧光图4(a).注射后3 h,全身近红外荧光强度明显降低,而来自肿瘤区域的近红外荧光信号与其他组织形成强烈对比,证实其EPR 被动靶向性能优异见图4(b-c).
图4 碳点在活体中的被动靶向作用：(a)注射NIR-CDs不同时间后的小鼠NIR 成像,(b)注射NIR-CDs不同时间后的小鼠H22肿瘤NIR成像(离体),(c)注射3 h小鼠的肿瘤和器官NIR 成像[46]；主动靶向作用：(d)FA 修饰碳点的靶向肿瘤细胞示意图和(e)接枝FA 后碳点的荧光成像对比图[35]
Fig.4 Passive targeting of carbon dots in vivo： (a)NIR fluorescence images of mouse bodies after intravenous injection of NIR-CDs for different time durations, (b)NIR fluorescence images of mouse H22 tumors(exvivo)after different time durations of injection of NIR-CDs,and(c)NIR fluorescence images of major organs and H22 tumors that were dissected from mice at 3 h postinjection[46]；Active targeting： (d)schematic diagram of FA modified carbon dots targeting tumor cells and(e)fluorescence imaging comparison of carbon dots grafted with or without FA[35]
2.1.2 主动靶向
主动靶向是指药物载体表面修饰连接特定的配体与肿瘤细胞表面的受体结合,既避免被巨噬细胞摄取,又能提高药物载体与肿瘤细胞的亲和性,使得载体易被细胞内吞,从而改善靶向制剂的靶向效率[47]。目前,基于叶酸(FA)-叶酸受体和透明质酸(HA)-CD44受体的主动靶向功能发展较为迅速,其原理借鉴了抗原-抗体的特异性识别。由于FA受体在肿瘤细胞膜表面高度表达,而在绝大多数正常细胞中不表达,利用FA 和FA 受体的高度亲和性,在受体的介导下将含有FA 和药物分子的载体输送到肿瘤细胞,达到靶向药物的目的[48]。类似地,CD44是细胞外的基质HA 的主要受体,其在恶性肿瘤细胞的表面也有异常表达,通过在载体表面修饰HA 可以让载体主动找寻CD44受体,从而将药物靶向递送至肿瘤细胞中[49]。
ZHANG et al[35]探索了一种碳点靶向药物递送系统的合成策略。在碳点表面修饰FA 并担载DOX,制备了一种兼具p H 响应性释放和成像功能的靶向药物递送系统,如图4(d)所示。激光共聚焦显微镜结果显示,由于特异性靶向分子FA 的作用,碳点在肝癌细胞(HepG2)中荧光成像效果明显优于正常肝细胞。在胞内释放实验中,该药物递送系统在正常肝细胞中24 h释放DOX 平均荧光强度为180.95,明显低于在HepG2 细胞中的荧光强度820.86,达到药物靶向选择性释放,进一步证实FA的靶向作用见图4(e)[50].AMORA et al[51]使用HA-磷脂(HA-DMPE)偶联物修饰洋葱碳,提升其癌细胞靶向性的同时,改善洋葱碳的溶解度。制备得到的纳米偶联物(CNO：f-HA-DMPE)在过表达CD44的人乳腺癌细胞中显示出良好的体外细胞活力,与检测不到CD44的人卵巢癌细胞相比,表现出更高程度的摄取率,表明该纳米偶联物是一种可用于靶向癌细胞的纳米复合材料。
2.2 药物担载策略
在纳米碳基靶向药物递送系统的开发中,高的药物负载量和定点缓慢释放能力成为近年来的研究热点。对药物递送材料的研究表明,材料的结构、成分及其表面改性修饰都会影响药物分子的负载和缓释行为[50]。药物与载体之间可通过共价键(如酰胺、酯和肼),非共价键(如借助相反电荷的静电吸引和氢键相互作用等),或二者结合的方式与纳米碳基载体偶联[52-53]。药物分子的缓释也可以借助其对肿瘤微环境的p H 值、离子强度以及电位差等响应性实现[54]。
2.2.1 共价键
共价键是两原子之间通过平均共用电子而产生的新化学键。以共价键载药的方式通常体现出药物和载体之间的作用力较强,能够更加稳定地将药物输送到靶区释放。CHAUDHURI et al[55]将DOX和聚乙二醇(PEG)同时衍生到C60表面,得到具有良好生物相容性的C60-DOX 给药系统如图5(a)所示。C60将DOX 携带进入到肿瘤细胞内部,在溶酶体中DOX 被释放出来。体内抗肿瘤活性实验表明,与DOX 相比,C60-DOX 能够更多地分布于肿瘤组织中,最终表现出良好的抗肿瘤活性。
图5 不同纳米碳材料的药物担载策略
Fig.5 Drug loading strategies for different carbon nanomaterials
LI et al[56]以具有高共轭苯环的对苯二胺和对甲苯磺酸为碳源,160℃下反应6 h,一步溶剂热法制备了最佳激发和发射波长分别为585和615 nm的橙光碳点。同时,在其表面修饰细胞核靶向信号肽(NLS)后,制备了靶向细胞核碳点(CDs-NLS).随后,以对羧基苯肼(HBA)为中间体,通过对p H敏感的酰基腙键将DOX 负载到CDs-NLS上,以实现细胞核靶向长波长发射碳点药物递送系统(CDs-NLS-DOX)如图5(b)所示。该靶向细胞核碳点递药系统中DOX 的载药率高达59.4%,具有p H 响应的药物释放特性,在p H 为5.5的环境下25 h累积释药率为90.57%.皮下Hep G2荷瘤鼠模型中,经过尾静脉多次给药后,发现CDs-NLS-DOX 组的肿瘤抑制率明显高于游离DOX 和CDs-DOX 组,在体内同样表现出较强的抗肿瘤效果。
2.2.2 非共价键
非共价键就是两个或多个原子不共同使用它们的外层电子,在理想情况下达到电子饱和的状态,由此组成比较稳定的化学结构叫做非共价键。传统的药物递送系统中,药物和载体之间的结合方式绝大多数都是非共价键,如氢键、离子键、偶极-偶极作用、疏水作用和芳香环作用等。该作用方式是一个可逆过程,即担载与释放之间的平衡过程。与载体结合的非共价药物分子,在改变环境的条件下更容易被释放出来。SUN et al[57]利用碳点与DOX 之间的π-π堆叠和静电相互作用构建药物递送系统,并采用Stern Volmer方程式计算碳点和DOX 的结合常数为63 L/g,可以推断二者之间的非共价相互作用。分别对碳点在p H=5.0和7.4的PBS溶液中的DOX 担载行为进行定量研究发现,DOX 的担载量随其初始浓度的增加而逐渐增加。同时,碳点上的DOX 担载率具有明显的p H 依赖性。当DOX的浓度高于300 mg/m L 时,p H=7.4下的担载率(260%)显著高于p H=5.0下的担载率。这一趋势归因于DOX 在较低p H 下的质子化,说明低p H 降低了DOX 和碳点之间的静电结合作用。DOX 释放行为研究显示,当p H=5.0时,CD-DOX 偶联物的DOX 释放量明显比p H=7.4的大,证实其p H响应释放能力。
YU et al[58]利用表面阳离子特性的PEI钝化碳点(CD-PEI)和带阴离子特性的DOX 通过静电作用相结合制备抗肿瘤药物递送系统(CDs-PEIDOX)用于癌症治疗,如图5(c)所示。其中,DOX的担载率为35.88%.研究结果表明,CD-PEI-DOX药物递送系统具有明显的p H 响应释放行为。将p H 从7.4调整为5.2,DOX 的释放量从7%增加到72%,几乎增加了10倍。此外,游离DOX 在10 h内完全释放,而CD-PEI-DOX 在p H 为5.2和6.0时持续了很长时间(＞72 h).该系统不仅改善了选择性药物释放,而且延长了药物释放时间。体内治疗研究表明,复合CDs-PEI-DOX 比游离DOX 具有更好的肿瘤生长抑制作用。
2.2.3 共价键和非共价键相结合
共价键和非共价键的协同作用不但可以增加药物的担载量,同时可以延长药物的释放时间,起到缓释治疗的作用。ZHANG et al[59]选择空心碳点(HCDs)作为药物载体,DOX 作为模型药物,以制备基于碳点的药物递送系统(HCD-DOX).通过对HCD-DOX 的结构研究发现,HCDs和DOX 之间不仅存在静电相互作用,同时,HCDs 的—NH2与DOX 的—C＝O 反应形成的—N＝C—在DOX 加载过程中发挥了重要作用(图5(d)).因此,HCDs-DOX具有较高的DOX 担载率(～42.9%),且在治疗过程中表现出持续的p H 靶向释放作用和更低的细胞毒性。
3 肿瘤靶向治疗
零维纳米碳基靶向药物递送系统良好的生物相容性、靶向性以及药物担载能力使其在肿瘤靶向治疗领域崭露头角,尤其是在化疗、基因治疗以及诊疗一体化等方面。
3.1 化疗
化疗就是化学治疗,主要是通过化疗药物对恶性肿瘤起抑制作用,通常是全身性治疗。然而,由于化疗药物通常不具有靶向性,在杀伤肿瘤细胞的同时也大量的杀伤正常细胞,从而具有大的毒副作用。DOX 是一种广谱抗肿瘤化疗药物,可通过抑制RNA 和DNA 的合成而抑制肿瘤细胞的增殖。担载DOX 的零维纳米碳基药物递送系统因其能够将DOX 靶向递送至肿瘤区域释放,显著降低毒副作用受到研究者们广泛关注。郑静尝试采用主被动靶向相结合的靶向药物递送策略,制备磁靶向有序介孔纳米碳球(FA-Hydrazine-MOMCNs),并在其表面担载DOX 构建靶向药物递送系统(DOX-FA-Hydrazine-MOMCNs)[41]。以RLE-6TN 和He La 细胞为效应细胞考察FA-Hydrazine-MOMCNs的体外细胞毒性,发现细胞存活率具有浓度依赖性和时间依赖性。体外肿瘤细胞的抑制实验表明,担载DOX 之后的靶向药物缓释系统对于癌细胞的抑制作用明显低于纯DOX 组的抑制作用,同一时间、同一浓度下未修饰FA 的药物递送组(DOX-Hydrazine-MOMCNs)对癌细胞的抑制率低于DOX-FAHydrazine-MOMCNs组,说明FA 的修饰,使得载药系统通过FA 受体的作用更多地进入HeLa细胞内,从而释放出更多的DOX,并杀死癌细胞,如图6(a)所示。对不同组别与HeLa细胞作用后的细胞形态与数量观察发现,空白对照组的细胞生长良好,形态均一；纯DOX、DOX-Hydrazine-MOMCNs和DOX-FA-Hydrazine-MOMCNs缓释系统作用于细胞12 h后,三组活细胞数量均明显下降,形态皱缩,凋亡细胞增多。在同一视野范围内,可以清晰地看到正常生长的He La细胞呈梭形,而已经凋亡的癌细胞呈圆形如图6(b)所示。DOX-FA-Hydrazine-MOMCNs组活细胞数量明显少于DOX 组和DOX-Hydrazine-MOMCNs组,细胞形态变化较明显。可以证实这两种靶向药物缓释系统是有体外抗肿瘤活性的潜力,也间接反映了DOX-FA-Hydrazine-MOMCNs能够靶向HeLa细胞,具有更强的抗肿瘤作用。
图6 (a)DOX-FA-Hydrazine-MOMCNs与对照组和HeLa细胞共孵育48 h的细胞存活率,(b)当DOX 作用于12 h后HeLa cells后细胞形态的观察不同组对小鼠肿瘤的抑制作用：i) 对照组,ii)DOX 组,iii)DOX-Hydrazine-MOMCNs组,iv)DOX-FA-Hydrazine-MOMCNs组[41],(c)作用33 d小鼠的肿瘤照片,(d)肿瘤体积和时间的变化曲线,(e)肿瘤抑制率和时间的变化曲线[58]
Fig.6 (a)Cell viability of HeLa cells after co-incubation with control and DOX-FA-Hydrazine-MOMCNs for 48 h(b)Cell morphology observation of HeLa cells after 12 h of DOX treatment：i)control group,ii)DOX,iii)DOX-Hydrazine-MOMCNs and iv)DOX-FA-Hydrazine-MOMCNs[41]；Anticancer effect of the different groups in tumor-bearing mice： (c)image of tumors on day 33, (d)tumor size as a function of time, (e)tumor inhibition rate as a function of time[58]
YU et al[58]以肝癌细胞(MHCC-97L和Hep3B细胞)为模型,研究CD-PEI-DOX 药物递送系统对肿瘤细胞的抑制性能。体内实验对比了不同组别样品对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用,如图6(c)所示,所有DOX 组的肿瘤生长都显示出显著的抑制作用,而PBS对照组的肿瘤体积迅速增加。CD-PEI-DOX组显示出所有组中最低的生长速率,这与在体外观察到的抗癌效果一致,如图6(d-e)所示。尽管CDPEI-DOX 和游离DOX 都能抑制肿瘤生长,而CDPEI-DOX 的抑制活性高于游离DOX,说明EPR 效应使CD-PEI-DOX 能够在肿瘤部位实现靶向递送和有效积聚。
3.2 基因治疗
基因治疗作为一种新的癌症治疗方式,受到了研究者的青睐。它是指将外源基因通过基因转移技术将其插入癌症患者适当的受体细胞中,使外源基因纠正或补偿基因缺陷,从而在遗传水平上治疗癌症。通过转录调控多种功能不同的分子的表达,对机体神经系统、内分泌系统和免疫系统具有刺激作用,产生一系列的神经因子、激素及细胞因子,增强免疫系统功能,有效促进肿瘤细胞的杀灭[11]。但是,由于外源性的基因容易被血液清除,很难到达癌组织区,通常需要载体将其递送至靶区实现高效的治疗作用。此外,基因本身自带的负电荷特性使其难以通过细胞膜进入癌细胞内,因此,带正电的纳米碳基基因递送系统不断被开发以提升其摄取效率。
将C60进行水溶性和表面电荷修饰,使其表面带正电,然后将DNA 通过静电作用吸附到C60表面的正电中心上,获得C60基因递送系统。该系统能高效携带DNA 进入细胞内,其转染效率与PEI(25 k Da)相当,证实C60衍生物是一种良好的基因递送载体[60]。
薛文强[61]以柠檬酸和硅烷偶联剂为碳源,制备了碳点(CDs),将已制备好的CDs与支化聚乙烯亚胺(PEI)在催化剂的作用下合成阳离子碳点(PEICDs),同时在其表面接枝上FA 使具有主动靶向的能力,并且以Survivin 双链小干扰RNA(Survivin siRNA)为模型基因,构建了主动靶向型阳离子碳点携载Survivin siRNA(FA-PEI-CDs@survivin siRNA)的输送系统。Survivin siRNA 可靶向沉默肿瘤细胞中的Survivin 基因来促进凋亡信号转导通路的连接,重启肿瘤细胞的凋亡机制。体外细胞实验证实FA-PEI-CDs@survivin siRNA 能够特异性杀伤肿瘤细胞,而对正常的肝细胞无损害作用,并以携载Survivin siRNA 效应能力最强。体内抑瘤实验考察FA-PEI-CDs@Survivin siRNA 的抗肿瘤效果,从给药结束后荷瘤鼠的形态和解剖出的肿瘤图片可见,载体组和FA-PEI-CDs@阴性siRNA 组的肿瘤体积差异较小,接近于对照组的瘤积,注射FAPEI-CDs@siRNA-3的荷瘤鼠体积缓慢增长,直径体积远小于其余分组。并通过定量分析不同处理组对肿瘤的抑制作用,发现与对照组相比,FA-PEICDs@siRNA-3组对肿瘤的抑制作用为58.6%.
3.3 诊疗一体化
将肿瘤诊断或监测与治疗结合构建的诊疗一体化技术能够高效地观察肿瘤组织,对肿瘤治疗进行实时监测,显著提升治愈率,是肿瘤治疗未来发展的重要方向[34]。零维纳米碳材料不但可以作为药物载体,同时可以作为分子影像探针、光敏剂或者光热转换剂在肿瘤诊疗一体化中受到广泛关注[13]。
SHI et al[62]首先在富勒烯碳笼表面负载氧化铁纳米颗粒(IONP),然后依次在其表面修饰PEG和FA,改善其亲水性的同时赋予对肿瘤细胞的靶向性,最终开发了一种基于富勒烯的诊疗一体化纳米材料(C60-IONP-PEG-FA).IONP在肿瘤细胞的酸性环境中可以分解产生Fe3+,可以作为磁共振成像(MRI)造影剂,增强MRI效果。同时C60-IONPPEG-FA 可以通过FA 的特异性靶向作用,联合富勒烯的光动力治疗和Fe3+的射频热治疗,实现多种手段协同治疗肿瘤的目的,大大地提高了肿瘤的治疗效率。
在CDs中掺杂磁性组分得到的磁性碳点,使其兼具碳点的荧光特性和金属的磁学性质,可作为荧光/磁共振成像(FL/MRI)分子探针用于肿瘤的双模态成像与治疗[63]。CHIU et al[64]将S、N 和Gd掺杂的磁性CDs(Gd NS@CQDs)通过酰胺化反应与FA 偶联,借助静电相互作用负载DOX 构建了一种靶向药物递送系统(FA-Gd NS@CQDs-DOX).图7(a-d)为用FA-Gd NS@CQDs-DOX 处理HeLa细胞的共聚焦显微镜荧光图像,其在HeLa细胞的细胞质中积累并发出蓝色荧光,DOX 内化到细胞核中并发出红色荧光,验证了FA-Gd NS@CQDs-DOX可以标记癌细胞并将药物递送到癌细胞的细胞核。此外,用FA-Gd NS@CQDs-DOX 处理HeLa细胞的T1加权MR 图像更亮,如图7(e-f)所示,说明FA 更容易与He La细胞结合,证明了其对He La细胞的靶向性。FA-Gd NS@CQDs对DOX 的载药量约为80%,在p H 值从7.5调至5.0的72 h内释放DOX 量从25%增加到62%(图7(g)),说明其对DOX 具有p H 可控释放能力。从图7(h-i)中发现用FA-Gd NS@CQDs-DOX 处理的HeLa细胞表现出更强的细胞增殖抑制能力。
图7 (a)细胞核用Nuc View 染色,绿色发射表示细胞核的位置,(b)蓝色发射表示FA-Gd NS@CQDs在细胞内的位置,(c)红色发射为DOX 的荧光,(d)荧光图像覆盖(a)、(b)和(c)图像；用不同浓度的FA-Gd NS@CQDs处理的(e)He La和(f)HepG2细胞的T1加权MR 图像；(g)Gd NS@CQDs和Gd-DTPA 的r1与Gd3+浓度之间的线性关系；(h)不同p H 值为7.4、6.0和5.0时,FA-Gd NS@CQDs-DOX 中DOX 的释放量；经FA-Gd NS@CQD-DOX 和DOX 处理后的细胞的细胞毒性((i)He La和(j)Hep G2)[64]
Fig.7 (a)Cell nuclei stained with Nuc View,green emission indicates the location of the nucleus, (b)blue emission indicates the location of FA-Gd NS@CQDs within the cell, (c)red emission is the fluorescence of DOX, (d)fluorescence images overlaying (a), (b)and(c)images； (e)He La treated with different concentrations of FA-Gd NS@CQDs and(f)T1-weighted MR images of Hep G2 cells； (g)Linear relationship betweenr1and Gd3+concentrations of Gd NS@CQDs and Gd-DTPA； (h)DOX release from FA-Gd NS@CQDs-DOX at different p H values of 7.4,6.0,and 5.0；After treatment with FA-Gd NS@CQD-DOX and DOX of(i)HeLa and (j)HepG2 cells cytotoxicity[64]
JIAO et al[65]合成了以AS1411为配体的红光发射的磁性碳点(AS1411-Gd-CDs),用于靶向FL/MRI双模态成像引导的光热治疗。以4T1荷瘤小鼠为模型,研究AS1411-Gd-CDs的体内FL/MRI双模态成像效果,验证其在肿瘤部位的高保留和积累作用。静脉注射AS1411-Gd-CDs后4 h,小鼠体内肿瘤区域的FL 和MRI信号更强,见图8(a-d).研究PBS溶液和AS1411-Gd-CDs悬浮液的光热效应,发现在808 nm 激光照射10 min后,质量浓度为500μg/m L的AS1411-Gd-CDs悬浮液温度升高到66℃,而PBS 溶液的温度仅增加到24℃,说明AS1411-Gd-CDs具有较高的光热转换效率。当用808 nm 激光照射注射AS1411-Gd-CDs的小鼠肿瘤部位一段时间后发现,肿瘤抑制作用较好,并且小鼠体重无明显减轻,说明AS1411-Gd-CDs的光辅助治疗效果优异,见图8(e-f).
图8 (a)荷瘤鼠注射Gd-CDs和AS1411-Gd-CDs后的荧光成像图(红圈表示肿瘤区域),(b)注射不同时间后肿瘤区域内的FL信号强度,(c)注射Gd-CDs和AS1411-Gd-CDs不同时间后肿瘤区域内的MRI信号强度,(d)荷瘤鼠在注射Gd-CDs和AS1411-Gd-CDs前和注射后不同时间段的肿瘤T1加权MRI成像图(红圈表示肿瘤区域),(e)各组4T1荷瘤鼠的照片和治疗14 d后肿瘤的
染色结果(标尺=100
),和(f)光热治疗后第14 d各组肿瘤的照片(1：生理盐水,2：NIR only,3：Gd-CDs,4：AS1411-Gd-CDs,5：Gd-CDs+NIR 和6：AS1411-Gd-CDs+NIR)[65]
Fig.8(a)Invivofluorescence imaging of tumor-bearing mice after intravenous injection of Gd-CDs and AS1411-Gd-CDs,the red circles indicated the tumor area；(b)Fluorescent signal intensities within tumor regions for different time；(c)T1-weighted MRI signals of the tumors at determined time points after administration of Gd-CDs and AS1411-Gd-CDs；(d)T1-weighted MR imaging of mice model pre-and post-injection of Gd-CDs and AS1411-Gd-CDs at various time intervals,the red circles indicated the tumor area；(e)Photographs of 4T1 tumor bearing mice and thestaining of the tumor at 14 d for various groups (scale bar=100
)and(f)photos of tumors dissected from each group on the 14th day after photothermal treatment(1：saline,2：NIR only,3：Gd-CDs,4：AS1411-Gd-CDs,5：Gd-CDs+NIR,and 6：AS1411-Gd-CDs+NIR)[65]
DEHVARI et al[66]制备了具有良好荧光特性和磁学弛豫率(r1=5.3 m M/s)的锰、氮和硫掺杂碳点(Mn NS：CDs),并以其为载体,以HA 为靶向配体开发了一种碳点靶向递送药物系统(Mn NS：CDs@HA/DOX).MnNS：CDs@HA 在小鼠黑色素瘤细胞(B16F1)的细胞质中发蓝色荧光。MRI成像研究发现,随Mn NS：CDs浓度的增加B16F1 细胞的MRI图像越来越亮,说明Mn NS：CDs@HA 可以实现靶向FL/MRI双模态成像。通过体外实验得到CDs对DOX 的载药率为(72.0±5.0)%,Mn NS：CDs@HA/DOX 在p H 为5.0时72 h的DOX 释放量为(65.1±0.8)%.经Mn NS：CDs@HA/DOX 处理的B16F1细胞死亡率更高,表明其是一种优异的靶向诊疗一体化的碳点药物递送系统。
4 结论与展望
纳米碳基靶向药物递送系统能够对药物进行靶向和控释输运,进而在肿瘤治疗中起到高效低毒的作用,有助于提高肿瘤的化疗治愈率。本文对近年来零维纳米碳基药物递送系统在肿瘤治疗方面的研究工作进行了归纳总结。全面系统地分析各种纳米碳材料作为药物载体的特点,并总结其在药物递送和肿瘤治疗过程中的性能,最终获得不同纳米碳结构对药物递送性能的影响规律,为其在生物医药领域中的应用提供借鉴。主要结论包括：
1) 纳米碳结构对药物递送性能的影响。合适的尺寸是零维纳米碳材料能够作为药物递送载体的首要条件,尺寸越小,越有利于其在生物环境中的循环代谢；适宜的表面组成是零维纳米碳材料能够担载药物的关键因素,表面活性位点越多载药能力则越强；孔结构丰富、比表面积大为改善纳米碳的药物递送性能提供可能。
2) 靶向与药物担载策略对药物递送性能的影响。赋予零维纳米碳靶向肿瘤组织的能力,可以显著降低药物治疗的毒副作用并提升治疗效率。无论是主动靶向还是被动靶向都能够承担这一作用。共价键、非共价键或者二者结合的方式有利于提高药物担载和缓释的能力,进而在肿瘤的靶向治疗中体现更好的效果。
3) 纳米碳基靶向药物递送系统的诊疗机制。纳米碳基靶向药物递送系统对肿瘤的靶向诊疗,本质上是其在进入生物体内后,在组织、血管和细胞中的循环过程,能够顺利避开生物体内的各种干扰,将药物靶向递送到肿瘤细胞内部释放并发挥治疗作用,同时结合其自身的光学性能做到肿瘤的诊疗一体化,使得监测与治疗协同进行,从根本上提高治疗效率。
总的来说,在今后的研究工作中,还需要针对纳米碳材料的本体结构和表面修饰两方面共同改进,进而提升其肿瘤治疗效果,主要包括以下三个方面：
1) 制备粒径均一可控、高比表面积的零维纳米碳材料,使其既能满足细胞给药的粒径尺寸,又能达到高效载药的目的；
2) 采用主被动靶向相结合策略,更大程度地提高其入胞能力,同时可利用多重的刺激响应机制,减少药物在体内的过早释放,达到缓控释的目的；
3) 纳米碳材料在体内的输送和代谢以及其对免疫系统的影响等需要进一步的研究。
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