多酶催化级联反应是一种连续实现酶催化反应和生物转化的一锅级联过程,因反应途中避免了反应中间体的分离与纯化,从而降低了工艺成本[1-3]。除此之外,酶分子间距离很近,中间产物无需费力就可与下个目标酶的活性位点接触实现反应的快速转化,以获得更高的产量,提高原子经济性[4-5]。酶促反应条件一般较为温和,能够在常温常压下实现,具有高效性与专一性等优势[6-7]。然而,酶自身的脆弱性与操作不稳定性严重限制了其在多酶催化系统中的广泛应用。纳米酶因其成本低、比表面积大、在极端条件下具有良好的稳定性而被视为天然酶的替代品[8-9]。然而,纳米酶的中等活性和有限的选择性阻碍了它们的应用。因此,将天然酶的高选择性与纳米酶的高稳定性相结合,以提高生物催化级联的多样性/复杂性和多酶系统的稳定性,已成为一种理想的解决方案[10-11]。
目前,多种纳米材料已被发现具有独特的模拟酶催化活性,如碳基纳米粒子[12]、金属纳米粒子[13-14]和金属氧化物纳米粒子[15-17]等。其中Fe3O4纳米颗粒因其超顺磁性与类过氧化物酶活性而备受关注,被广泛用于药物输送[18]、医学诊断[19]和催化[15,20]等领域。然而,Fe3O4纳米颗粒对氧化条件的高度敏感性,极大地限制了应用范围[10]。Fe3O4纳米颗粒外包覆稳定的壳层材料,或许是一种有效的策略。
金属有机框架[21-23](MOFs)和共价有机框架[24-25](COFs)因高的比表面积、可调的孔隙以及良好的热稳定性等优良特征,已经成为近些年来固定化酶领域炙手可热的载体材料。然而,部分MOFs长期在水中表现出不稳定性和易分解的现象,产生金属离子的浸出,对酶的催化活性造成不利影响。作为MOFs的姊妹材料,COFs不含有毒金属离子,且长期的水/化学稳定性使其备受青睐[26]。由于Fe3O4仅在酸性条件下具备良好催化性能,因此,我们选择化学稳定性更好的COFs作为Fe3O4的壳层,一方面COFs外壳的高热/化学/机械稳定性可改善Fe3O4的稳定性,另一方面COFs可调的孔径与高孔隙率能够促进酶的固定与底物传质。同时,COFs中引入Fe3O4也为解决COFs在溶液中分散不均匀和难以回收等难题提供了一个理想方案[26]。
本文中,设计合成了一种核壳结构的离子型Fe3O4@EB-COFs磁性纳米材料,借助材料表面的正电荷,无需考虑物理吸附时材料孔径与酶尺寸匹配要求,以静电诱导的方式便可将葡萄糖氧化酶(GOx)固定于纳米材料上,实现了纳米酶与天然酶的多酶催化级联反应。其中,Fe3O4@EB-COFs担任纳米酶与载体材料的角色,与GOx结合后,生物复合材料表现出优异的催化活性、出色的稳定性与良好的重复使用性,并且实现了葡萄糖的一锅法比色测定,表明其在体外或体内研究中的潜在应用。
1 实验部分
1.1 实验试剂
所有化学品和试剂均从商业来源购买,使用时没有进一步净化。六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、溴化乙锭(EB)、2,4,6-三羟基-1,3,5-苯三甲醛(Tp)、葡萄糖氧化酶(GOx)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、葡萄糖、异硫氰酸荧光素购自中国上海阿拉丁化学有限公司。Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。所有溶液均采用超纯水(比电阻率18 MΩ/cm)配制。
1.2 实验仪器
X射线衍射仪(XRD)测试是在Bruker D8 Advance衍射仪上进行的,该衍射仪采用Cu-Kα辐射,工作电压为40 kV,电流为40 mA.分为两段扫描,2°～10°时扫描速率为1 (°)/min,10°～80°扫描速率为4 (°)/min.Quantachrome Autosorb IQ2分析仪进行了N2吸附测试,固定化酶前样品预处理温度为120 ℃,持续12 h.为了避免高温引起的酶变性构象的改变,固定化酶后的样品脱气温度由120 ℃降低到30 ℃,持续12 h.在Hitachi S4800扫描电子显微镜上进行了15 kV加速电压下的扫描电子显微镜测量。扫描前,试样表面喷金,以增强试样的导电性。Zeta电位测试是在Malvern Zetasizer Nano ZS90电位仪进行的,将1 mg样品分散于1 mL去离子水中,超声3 min,用NaOH或者HCl将溶液pH值调至7,测量材料的Zeta电位,三次测试结果取平均值。
1.3 Fe3O4@EB-COFs的合成
Fe3O4的合成:将六水合氯化铁(FeCl3·6H2O,2.025 g) 溶于50 mL乙二醇,不断搅拌完全溶解后,再加入二水合柠檬酸钠(Na3Cit2·2H2O),继续搅拌,然后缓慢加入乙酸钠(CH3COONa),剧烈搅拌30 min,最后转移到100 mL的聚四氟乙烯内衬反应釜中,在200 ℃烘箱中反应12 h.待反应釜冷却至室温后,将其中固液混合物倒出,黑色产物反复用水和乙醇洗涤,用磁铁回收,最后在60 ℃真空烘箱中干燥6 h,即可得到产物。
Fe3O4@EB-COFs合成:将Fe3O4(69.5 mg,0.3 mmol)加入到装有1.5 mL 1,4-二氧六环与1.5 mL均三苯混合溶液的Pyrex管,超声5 min,加入溴化乙锭(EB,177.3 mg,0.45 mmol),超声5 min,继续加入2,4,6-三羟基-1,3,5-苯三甲醛(TP,63 mg,0.3 mmol),超声10 min,加入0.5 mL 3 mol/L乙酸水溶液中,然后将Pyrex管放入液氮中经冷冻-抽真空-解冻循环脱气三次,除去管中的空气。最后将管密封在120 ℃烘箱中反应72 h.反应完成后,将Pyrex管自然冷却至室温,所得产物用四氢呋喃(THF)洗涤3次,使用磁铁帮助回收产物,再经200 mL甲醇∶THF(体积比1∶1)混合液索氏提取12 h,最后在100 ℃真空干燥12 h得到红色粉末。
1.4 GOx/Fe3O4@EB-COFs的制备及固定化最优条件的探索
将5 mg Fe3O4@EB-COFs超声悬浮在5 mL磷酸缓冲液(50 mmol/L,pH=7.0),然后加入5 mL GOx溶液(2.5 mg/mL),放置于200 r/min摇床中混合2 h保证吸附饱和。通过外加磁铁获得固定化酶材料,然后分散至2 mL水在混匀仪中震荡30 s洗掉吸附松散的酶,再磁回收材料,重复上述洗涤过程3次,收集滤液,然后用紫外-可见分光光度计,通过Bradford法测定溶液中酶的浓度。平衡吸附量qe(mg/mg):
式中:ρ0与ρe分别为固定化前后酶溶液的质量浓度,V为酶溶液的体积,m为COFs的质量。
通过逐步改变固定化过程中的影响酶负载的因素,如溶液pH(5～8),葡萄糖氧化酶(GOx)的质量浓度(0.5～5 mg/mL)与固定化时间(0～3 h),得出Fe3O4@EB-COFs固定化GOx的最优条件。
1.5 GOx/Fe3O4与GOx/Fe3O4@EB-COFs级联活性测试及最优催化条件探索
GOx/Fe3O4@EB-COFs活性测试:将1 mg GOx/Fe3O4@EB-COFs加入到1 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(50 mmol/L,pH=3.5)混匀后,取0.1 mL加至1 mL葡萄糖溶液(50 mmol/L,pH=3.5)、1 mL 2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液(ABTS,2 mmol/L,pH=3.5)与0.9 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液中,55 ℃孵育30 min,然后用磁铁在外部回收生物复合材料,采用紫外分光光度计在415 nm处测试所得溶液的吸光度值。ABTS摩尔消光系数为ε415=36 000 L·mol-1·cm-1,酶活单位(U)定义为每分钟催化生成1 μmol ABTS+·的酶的量。级联反应的催化活性以三次重复测量结果的平均值计算。
GOx/Fe3O4活性测试:将上述GOx/Fe3O4@EB-COFs换做等量的Fe3O4与GOx,然后按照上述方法测试级联反应活性。
通过改变上述反应葡萄糖浓度 (1～100 mmol/L)、温度 (35～85 ℃)、pH值(3～9)得出GOx/Fe3O4@EB-COFs的最优级联反应条件。
1.6 GOx/Fe3O4@EB-COFs动力学参数的测定
通过在最优工艺下改变级联反应中ABTS浓度(0.4～2 mmol/L),测试GOx/Fe3O4@EB-COFs的反应活性,得出各ABTS浓度(c)下反应初始速率(v),绘制出1/c与1/v的双倒数图,然后通过Lineweaver-Burk方程计算出反应的Km与Vmax:
式中:c为ABTS浓度,mmol/L;v为初始反应速率,mmol/(L·min);Km为米氏常数,mmol/L,反映了酶与底物的亲和力大小,vmax为最大反应速率。
1.7 GOx/Fe3O4@EB-COFs稳定性测试
首次测试GOx/Fe3O4@EB-COFs级联反应催化活性后,通过外加磁场实现材料的回收,经乙酸-乙酸钠缓冲溶液(50 mmol/L,pH=3.5)洗涤一次后,继续用于下次循环。首次循环中,GOx/Fe3O4@EB-COFs的催化活性被认为是100%.
1.8 葡萄糖比色测定
1 mg GOx/Fe3O4@EB-COFs加入到含有1 mL不同浓度的葡萄糖溶液(50 mmol/L,pH=3.5)、1 mL ABTS溶液(2 mmol/L,pH=3.5)与1 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(50 mmol/L,pH=3.5)的10 mL离心管中,然后在55 ℃孵育30 min,外加磁铁回收GOx/Fe3O4@EB-COFs,使用紫外分光光度计测定所得溶液在415 nm处的吸光度值,绘制出葡萄糖浓度与吸光度值曲线,得出GOx/Fe3O4@EB-COFs对葡萄糖的检测范围与最低检测限。
为测试GOx对底物的专一性,进行了一组对照实验,使用5 mmol/L麦芽糖、5 mmol/L半乳糖、5 mmol/L蔗糖和5 mmol/L果糖代替葡萄糖,在相同的反应条件下观察溶液的吸光度值变化。
2 结果与讨论
2.1 Fe3O4@EB-COFs与GOx/Fe3O4@EB-COFs的制备与结构表征
GOx/Fe3O4@EB-COFs的制备流程如图1所示。首先,通过水热法合成了柠檬酸盐稳定的Fe3O4纳米颗粒,颗粒表面带有丰富的羧酸盐基团使其表面带有少量负电荷,促进了其溶液中的分散稳定性,这使得阳离子型COFs(EB-COFs)在其外表面生长成为了可能。其次,在均三甲苯/1,4-二氧六环溶液中,Fe3O4(0.3 mmol)作为磁芯,溴化乙锭(EB,0.45 mmol)和2,4,6-三羟基-1,3,5-苯三甲醛(TP,0.3mmol)作为构建单体,热力学可逆聚合后便在Fe3O4外形成EB-COFs外壳,得到Fe3O4@EB-COFs.索氏提取、干燥后称取适量的Fe3O4@EB-COFs浸入葡萄糖氧化酶(GOx,6.0 nm×5.2 nm×7.7 nm,PI=4.2)溶液中,在25 ℃ 200 r/min的摇床中孵育2 h,用磁铁回收后即可得到GOx/Fe3O4@EB-COFs,超纯水洗涤3次后,通过Bradford法测得GOx的固定化量为45 μg/mg.
图1 GOx/Fe3O4@EB-COFs的制备示意图
Fig.1 Preparation schematic diagram of GOx/Fe3O4@EB-COFs
为证实EB-COFs的包覆与GOx的固定化,首先对复合材料进行了Zeta电位测试,如图2所示。GOx的Zeta电位为-7.45 mV,Fe3O4的Zeta电位为-2.09 mV,这可能是由于表面含有羧基。然而Fe3O4@EB-COFs的Zeta电位为32.4 mV,证实了EB-COFs的成功包覆。固定化GOx后,GOx/Fe3O4@EB-COFs的Zeta电位降至19.8 mV,归因于葡萄糖氧化酶在材料表面的吸附。结果表明正负电荷产生的静电作用能够促进GOx吸附至Fe3O4@EB-COFs的表面。
图2 样品的Zeta电位图
Fig.2 Zeta potential plots of samples
通过扫描电子显微镜 (SEM) 和透射电子显微镜 (TEM) 对Fe3O4、Fe3O4@EB-COFs与GOx/Fe3O4@EB-COFs的形貌与尺寸进行分析。SEM图像观察到,Fe3O4(图3(a))为分散均匀的、表面粗糙的纳米颗粒,尺寸为100～150 nm,包裹COFs外层后Fe3O4@EB-COFs的形貌(图3(b))并未发生很大变化,尺寸增大到120～170 nm.固定化脂肪酶后GOx/Fe3O4@EB-COFs(图3(c))的表面形貌未发生明显变化。TEM图像显示出,Fe3O4@EB-COFs(图3(e))为核壳结构,其中Fe3O4(图3(d))核心约为150 nm,COFs壳层厚度约为20 nm,固定化GOx后(图3(f)),尺寸略微增大5 nm左右,可能归因于GOx吸附在COFs表面而不是进入孔道。
(a) Fe3O4, (b) Fe3O4@EB-COFs, (c) GOx/Fe3O4@EB-COFs的SEM图, (d) Fe3O4,
(e) Fe3O4@EB-COFs, (f) GOx/Fe3O4@EB-COFs的TEM图
图3 不同样品的电镜图
Fig.3 SEM and TEM images of samples
为证实所合成的复合材料为Fe3O4@EB-COFs,采用了傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 分析了复合材料的官能团结构。如图4所示,EB在3 185 cm-1和3 309 cm-1处的特征吸收峰归因于—N—H的伸缩振动,1 643 cm-1和2 889 cm-1处的谱带分别归属于TP的—C
O和—C—H的伸缩振动,587 cm-1的谱带属于特征Fe—O—Fe伸缩,位于1 396 cm-1和1 645 cm-1的吸收峰归因于 Fe3O4表面的羧基的羰基拉伸,证明了羧基的存在。与Fe3O4的光谱相比,Fe3O4@EB-COFs的光谱中也观察到相似的特征谱带。此外,还发现了在1 593 cm-1处存在的—CC伸缩的强吸收峰以及羟基(—OH)和亚胺键(—C
N)拉伸的缺失,证实了酮式EB-COFs的存在。结果表明,EB-COFs壳层通过席夫碱缩合反应成功覆盖在Fe3O4外表面。
图4 EB、TP、Fe3O4与Fe3O4@EB-COFs FITR谱图
Fig.4 FITR spectra of Fe3O4, TP, Fe3O4, and Fe3O4@EB-COFs
X射线衍射仪(XRD)进一步分析确定了Fe3O4@EB-COFs纳米颗粒的晶体结构。如图5所示,Fe3O4@EB-COFs的XRD图像在30.28°、35.46°、43.40°、53.28°、57.14°和62.76°处显示出6个2θ衍射峰,分别对应于Fe3O4的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面,这与磁铁矿的PDF卡片(88-0866) 一致,表明Fe3O4结晶良好,即使在包覆EB-COFs壳层后也具有高结晶度。对于COFs,特征峰出现在2θ的3.6°与27°左右,归因于原始六方晶格的(100)与(001)晶面,证实了EB-COFs晶体的形成。此外,在固定化GOx后,Fe3O4@EB-COFs晶体结构未发生明显变化,表现出较好的结晶度。
图5 Fe3O4、Fe3O4@EB-COFs与GOx/Fe3O4
@EB-COFs的XRD图
Fig.5 XRD patterns of Fe3O4, Fe3O4@EB-COFs,
and GOx/Fe3O4@EB-COFs
为了解复合材料的热稳定性与COFs壳层占比,对Fe3O4与Fe3O4@EB-COFs进行了热重测试(图6).与纯Fe3O4相比,Fe3O4@EB-COFs在300 ℃以上的重量损失几乎为60%,可能是COFs壳层开始瓦解,这意味着壳层的COFs占比很高。同时,Fe3O4@EB-COFs在300 ℃以下的长程平台也表现出良好的稳定性。
图6 Fe3O4与Fe3O4@EB-COFs的热重曲线
Fig.6 Thermogravimetric curves of Fe3O4and Fe3O4@EB-COFs
随后,使用振动样品磁强计(VSM)对纳米颗粒的磁性进行了表征。磁滞曲线(图7)显示出Fe3O4与Fe3O4@EB-COFs饱和磁化强度值分别为67.52 emu/g和31.20 emu/g.说明包裹COFs壳层后,复合材料仍具有超顺磁性,可对外部磁场实现快速响应。固定化GOx后,GOx/Fe3O4@EB-COFs的饱和磁化强度值降至16.28 emu/g.尽管如此,在外部磁铁的帮助下,仍观察到生物复合材料从悬浮液的快速聚集(1 min),有效避免了离心回收材料导致的损失与离心过程中酶泄漏问题,表明磁性COFs可作为固定化酶的理想载体。
图7 Fe3O4、Fe3O4@EB-COFs与GOx/Fe3O4@
EB-COFs的磁滞饱和曲线
Fig.7 Magnetic hysteresis saturation curves of Fe3O4, Fe3O4
@EB-COFs, and GOx/Fe3O4@EB-COFs
通过77 K下的N2吸附测试进一步评价了Fe3O4@COFs固定化GOx前后比表面积(BET)与孔隙结构的变化。由N2吸附-脱附等温线(图8(a))可得到,Fe3O4比表面积为25 m2/g,包覆COFs壳层后迅速增大至470 m2/g.另外,Fe3O4@EB-COFs为典型的I型曲线,表明该材料的微孔特性。固定GOx后,Fe3O4@EB-COFs的比表面积从470 m2/g减少到387 m2/g.使用DFT方法对Fe3O4@EB-COFs和GOx/Fe3O4@EB-COFs的孔径分布(图8(b))分析表明,两种样品的孔径都集中在约1.68 nm,孔体积从0.340 cm3/g下降到0.303 cm3/g,固定化GOx后,Fe3O4@EB-COFs的主体孔隙仅略微减小,可能归因于测试中低预处理温度未能将材料中的水完全干燥。结果证实了GOx是吸附在复合材料表面,这将有利于产物与底物在孔隙中传质。
图8 样品的孔结构表征
Fig.8 Pore structure of samples
为了进一步观察葡萄糖氧化酶(GOx)在载体上的分布,荧光素标记酶是证明其存在并确定其分布的一种光学方法,荧光探针荧光素异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记酶分子[26]。由于GOx本身不发荧光,首先GOx与FITC共价官能化,然后吸附于Fe3O4@EB-COFs上得到荧光素标记的生物复合材料FITC-GOx/Fe3O4@EB-COFs,用水反复洗涤3次以去除未吸附的酶,选用488 nm作为激发波长使用CLSM对样品进行成像。CLSM图像(图9)显示出绿色荧光效果,这一结果有力地证实了GOx成功吸附至Fe3O4@EB-COFs表面。
图9 FITC-GOx/Fe3O4@EB-COFs的CLSM图像
Fig.9 CLSM images of FITC-GOx/Fe3O4@EB-COFs
2.2 GOx/Fe3O4@EB-COFs的固定化条件优化
物理吸附法固定化酶时,不同的固定化条件会影响酶的负载,因此探究不同负载条件下(如溶液pH、GOx浓度与固定化时间)Fe3O4@EB-COFs对GOx的负载量变化情况,以实现Fe3O4@EB-COFs负载GOx的固定化条件优化。首先,对固定化时间的影响展开研究(图10(a)),随着固定化时间的延长,Fe3O4@EB-COFs表面吸附了越来越多的GOx,直至时间到达2 h附近后GOx吸附量增长得较为缓慢,可能是此时材料已经吸附饱和,所以将固定化时间选为2 h.溶液pH值的变化会导致酶表面的电荷属性发生变化,从而对酶的固定化产生影响,因此继续考察了不同pH值(5～8)溶液中GOx的吸附情况(图10(b)),溶液pH=5与pH=7时GOx的吸附量较高,但经活性测试后,发现溶液pH=5时固定化所得GOx/Fe3O4@EB-COFs活性大量丧失,反观溶液pH=7时所得生物复合材料却不受影响,因此将固定化溶液的pH值定为7.最后,通过改变固定化溶液中GOx的质量浓度(0.5～5.0 mg/mL),对吸附的最佳GOx质量浓度进行了确定。图10(c)清晰地表明,GOx质量浓度为2.5 mg/mL时吸附效果最优。意外的是,当GOx质量浓度高于2.5 mg/mL时,Fe3O4@EB-COFs对GOx的吸附量反而下降,可能是高浓度酶液中酶分子间易发生团聚,此时仅靠酶与材料间一些较弱的物理作用力(如:静电作用力、范德华力、氢键等)难以实现团聚酶分子的吸附。因此,把Fe3O4@EB-COFs对GOx固定化的最优条件确定为pH=7,2.5 mg/mL GOx溶液,吸附2 h.
图10 固定化时间、溶液pH值和GOx质量浓度对GOx负载量的影响
Fig.10 Effect of immobilization time, solution pH, andρ(GOx) on the immobilized amount of GOx
2.3 GOx/Fe3O4@EB-COFs的催化性能
GOx/Fe3O4@EB-COFs的催化活性是使用葡萄糖与ABTS作为底物的级联反应来测定的。具体而言,反应分为两步,GOx在有氧条件下将葡萄糖分解为葡萄糖酸与H2O2,接着通过芬顿反应产生羟基自由基氧化ABTS产生ABTS+·,即Fe3O4在酸性条件下浸出的Fe2+能够与H2O2反应生成羟基自由基进一步将ABTS氧化为ABTS+·(图11为反应示意图)。
图11 GOx/Fe3O4@EB-COFs催化级联反应的示意图
Fig.11 Schematic diagram of GOx/Fe3O4@EB-COF catalytic cascade reaction
级联反应中不同反应条件会导致不同的活性表现,因此我们测试不同葡萄糖浓度、温度与pH值环境下GOx/Fe3O4@EB-COFs的催化活性情况。首先,对葡萄糖浓度的影响展开了研究(图12(a)),最初随着葡萄糖浓度的增加溶液ABTS+·迅速增加,当葡萄糖浓度增加至50 mmol/L左右,ABTS+·浓度增长速率逐渐下降,因此将反应的葡萄糖最佳浓度设定为50 mmol/L.紧接着在不同温度环境下进行催化活性测试,我们得出GOx/Fe3O4@EB-COFs与GOx/Fe3O4均在55 ℃表现出最高的催化活性(图12(b)).最后,由不同pH值溶液的级联反应催化活性图(图12(c))可以看出,pH=3.5时产生了更多的ABTS+·,令人意外的是,理论上随着pH值的降低,Fe3O4有更多的Fe2+浸出表现出更高的催化活性,但当pH值继续降低至3时却生成了更少的ABTS+·,可能是此时GOx的构相受到破坏导致催化活性下降。因此,将上述各最优活性参数确定为级联反应的测试条件用于后续的活性测试。
图12 葡萄糖浓度、反应温度和溶液pH值对
GOx/Fe3O4@EB-COFs催化活性的影响
Fig.12 Effects of glucose concentration (a), reaction temperature (b), and solution pH (c) on the catalytic activity of GOx/Fe3O4@EB-COFs
为了解GOx/Fe3O4@EB-COFs的反应动力学特征,固定其他反应条件测试了不同ABTS浓度(0.4～2 mmol/L)的级联反应催化活性。根据Michaelis-Menten方程,紫外吸收分光光度计监测的ABTS+·浓度与反应时间几乎呈线性关系,这表明级联反应也遵循典型的酶促动态调节过程(图13(a)).由不同的ATBS浓度与不同的反应初速率拟合成几乎理想的线性关系Lineweaver-Burk图(图13(b)),从而计算出反应的动力学参数。结果表明,GOx/Fe3O4@EB-COFs催化底物为ABTS时,级联反应的Km为0.73 mmol/L,Vmax为4.19 μmol-1·L·min-1.
(a) 不同ABTS浓度下GOx/Fe3O4@EB-COFs催化级联
反应曲线;(b) GOx/Fe3O4@EB-COFs催化级
联反应的Lineweaver-Burk图
图13 GOx/Fe3O4@EB-COFs的催化级联反应
Fig.13 Catalytic cascade reaction curves of GOx/Fe3O4@EB-COFs
循环稳定性是决定生物催化剂实际应用的一个非常重要的参数。如图14所示,在外加磁场的帮助下,GOx/Fe3O4@EB-COFs重复使用10次后,其相对活性仍保持了88%,显示出良好的可重复使用性。表明了磁性COFs出色的磁回收能力,进一步证明了其作为固定化酶的理想载体材料的潜力。
图14 GOx/Fe3O4@EB-COFs的循环稳定性
Fig.14 Cyclic stability of GOx/Fe3O4@EB-COFs
2.4 葡萄糖的比色测定
基于GOx/Fe3O4@EB-COFs生物复合材料的双重酶活性,建立了用于葡萄糖比色测定的一锅策略,其中葡萄糖的氧化和H2O2的检测同时进行。葡萄糖的定性测定是在不同浓度的葡萄糖下进行的,于415 nm处检测溶液的吸光度变化,然后建立吸光度-葡萄糖浓度校准曲线(图15(a)).拟合回归方程为y=0.222 5x+0.133(R2=0.998),线性范围为(0.1～5)×10-3mol/L,检测限为33.3 μmol/L.因此,GOx/Fe3O4@EB-COFs用于一锅葡萄糖测定是一种简便、灵敏的方法。
(a) 葡萄糖比色测定校准曲线;(b) 葡萄糖比色测定的特异性分析(从左至右:果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖和葡萄糖)
图15 GOx/Fe3O4@EB-COFs的活性测试
Fig.15 Enzymatic activity of GOx/Fe3O4@EB-COFs
为了测试葡萄糖的比色测定是否具有特异性,使用果糖、半乳糖、麦芽糖与蔗糖进行了对比实验。比色法的选择性结果如图15(b),即使对照样品浓度达到了5 mmol/L,仍然未发现可检测的信号。因此,比色法显示出对葡萄糖检测的高选择性。
3 结论
本文采用两步法设计合成了Fe3O4@EB-COFs核壳结构复合材料,简单的物理吸附GOx后,便实现了纳米酶与天然酶的级联。由于无需对目标酶或载体材料进行化学修饰,因此GOx催化活性很大程度上保留了下来,在级联反应活性测试中表现优异。调节级联反应条件,得出GOx/Fe3O4@EB-COFs在55 ℃葡萄糖溶液(50 mmol/L,pH=3.5)中表现出最高活性,催化活性远远优于游离酶。此外,由于磁性纳米颗粒Fe3O4的存在,GOx/Fe3O4@EB-COFs表现出卓越的可回收性,循环使用8次后仍然保持88%左右的初始活性。更重要的是,GOx/Fe3O4@EB-COFs用于葡萄糖比色测定时呈现出高灵敏度、高选择性与广阔的线性范围((0.1～5)×10-3mol/L).这些研究表明,纳米酶的催化活性不仅能与天然酶相媲美,而且具有更高的稳定性与更低的成本,因此将纳米酶的高稳定性与天然酶的高选择性相结合构建出的多酶催化系统对于实现工业催化具有重要意义。
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