圆锥角膜是以角膜中央变薄、向前突出成圆锥形为特征的一种角膜疾病，患病率在0.030～4.790‰之间[1]。圆锥角膜的病因尚不明确，角膜基质变薄、结构改变是造成角膜向外扩张的主要原因。角膜基质占角膜厚度的90%以上，主要由胶原蛋白组成[2]，为角膜维持正常的屈光特性提供力学支持。病理状态下，胶原合成和降解的稳态失衡，胶原纤维结构发生改变，导致基质层变薄，角膜力学性能下降，抵抗变形能力降低，在眼内压及外界刺激下角膜扩张形成圆锥角膜[3]。胶原代谢异常是圆锥角膜发生的原因之一，胶原代谢相关的基因COLs、MMPs是圆锥角膜的易感基因[4]。已有研究[5-7]表明，圆锥角膜中胶原合成基因COLs、交联基因LOXs的表达降低，MMPs等降解基因表达升高，胶原含量减少。改善胶原的合成及交联程度对减缓圆锥角膜进程具有重要的意义。
圆锥角膜的治疗方法主要有角膜移植、角膜交联、佩戴接触镜等，临床上根据角膜厚度等参数和圆锥角膜进程选择合适的治疗手段。晚期圆锥角膜患者需进行角膜移植术，早中期圆锥角膜可通过佩戴角膜接触镜进行治疗，但受散光、屈光参差或高度近视、屈光不正等因素的限制[8]。角膜交联是目前治疗早期圆锥角膜的主要手段，通过胶原交联提高角膜的力学性能可以显著延缓圆锥角膜的进程，但交联方案在提高氧利用率及核黄素的通透性方面仍待进一步改进，新型交联剂的开发应用也是目前角膜交联研究的主要课题[9]。药物治疗圆锥角膜鲜有报道，研究发现，萝卜硫素能够降低兔圆锥角膜模型中角膜曲率，增加角膜中央厚度，防止圆锥角膜的进展[10]，为圆锥角膜的治疗提供了新思路。
乙酰唑胺是一种结晶磺胺类药物，可用于青光眼、高原反应、水肿等疾病的治疗[11-13]，在眼组织中，可通过抑制碳酸酐酶活性，减少房水生成从而降低眼压[12]。乙酰唑胺对眼组织的作用主要集中在对眼压的调节，对眼部其他疾病的作用尚不明确。对关节炎大鼠研究发现，乙酰唑胺药物治疗后，软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白基因表达及蛋白多糖的含量升高[14]。横向主动脉缩窄小鼠的研究发现，乙酰唑胺可以降低心脏组织中Ⅱ型胶原蛋白的表达[15]。上述研究推测，乙酰唑胺能够调节胶原等细胞外基质成分的代谢。鉴于此，本研究采用乙酰唑胺溶液处理人圆锥角膜成纤维细胞，分析处理后角膜细胞中胶原代谢基因表达及胶原含量的变化，探究乙酰唑胺调节圆锥角膜中胶原合成的机制。研究结果对揭示乙酰唑胺类药物在圆锥角膜中的作用具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 圆锥角膜成纤维细胞的提取及培养
人圆锥角膜组织来源于山西省眼科医院角膜病科，为角膜移植术后的遗弃组织，实验经太原理工大学伦理委员会批准。圆锥角膜组织按照实验室前期建立的方法用 0.5 mg/mL Ⅱ型胶原酶消化提取角膜成纤维细胞，加入含体积分数10%胎牛血清(FBS，Gibco)、体积分数1%青链霉素的DMEM/F12培养基(HyClone)，于37 ℃、体积分数5%CO2孵育箱中培养，传代3～4 次的细胞进行乙酰唑胺药物处理。
1.2 乙酰唑胺药物处理
将提取的圆锥角膜成纤维细胞以3×105个细胞/孔的密度接种到六孔板中，贴壁后更换为不含血清的DMEM/F12基础培养基，饥饿处理 6 h后加入100 μmol/L乙酰唑胺溶液，继续培养 24 h 后收集细胞和培养液上清，用于后续基因和蛋白水平检测。以相同培养条件下未进行乙酰唑胺处理的细胞作为对照。
1.3 实时荧光定量PCR( qPCR )检测基因表达
收集的圆锥角膜成纤维细胞经PBS清洗后，加入细胞裂解液，采用EastepSuper 总RNA 提取试剂盒(Promega，上海)提取胞内总RNA，采用PrimeScriptTM反转录试剂盒(Takara，大连)将提取的RNA反转录成cDNA.采用qPCR检测对照组和乙酰唑胺处理细胞中胶原合成(COLs)、羟基化修饰(P4Hs、PLODs)、交联(LOXs)、降解(MMPs、TIMPs)相关基因及抗氧化酶基因(NQO-1、HO-1)的表达变化。引物信息如表1所示，以管家基因GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
表1 qPCR引物
Table 1 List of Primers for qPCR
基因名称引物序列产物长度Genbank登录号GAPDHF5 -ATTCCATGGCACCGTCAAGG-3 R5 -CAGCATCGCCCCACTTGATT-3 107bpNM_001289746COL1A2F5 -CCCTGGCAGAGATGGTGCTCG-3 R5 -GGGGCCAGCAGGACCGACC-3 163bpNM_000089COL5A3F5 -GACGAAGCCACGGGTGACTACA-3 R5 -TCCCACAGGGGCAGAAATCC-3 188bpNM_015719COL3A1F5 -GGTGCTAATGGTGCTCCTGGACTG-3 R5 -AATACCAGCCTCACCGCGTTCAC-3 105bpNM_000090COL6A1F5 -ACTTTATCAACGACGCCACCG-3 R5 -GCCCACGACCACCACGAA-3 203bpNM_001848LOX3F5 -CAACAGGAGGTTTGAACGCTAC-3 R5 -GCTGACATGGGTTTCTTGGTAA-3 146bpNM_032603LOX4F5 -TTCACCCACTACGACCTCCTCA-3 R5 -CAGCAGCCTACAGTCACTCCCT-3 155bpNM_032211P4HAF5 -GGAGGACAGTATGAACCGCACTTC-3 R5 -GGCACCACCAGCTTCTACATCAC-3 129bpNM004199P4HBF5 -GACAGCGACCACACCGACAAC-3 R5 -TGCCGTCAGCTCCTCCGATTC-3 135bpNM000918PLOD2F5 -TTGCTGGTGGTCCAGAAGAAGTTC-3 R5 -ACGGTTGACATATGGAGCATAGCC-3 182bpNM182943PLOD3F5 -CGAACAGTTGGTGGAGGACAGAAG-3 R5 -CGGCCAGAATCACGTCGTAGC-3 115bpNM001084TIMP1F5 -CCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAG-3 R5 -AAGGTGGTCTGGTTGACTTCTGGT-3 138bpNM003254TIMP2F5 -GCCAAAGCGGTCAGTGAGAA-3 R5 -TGATGTGCATCTTGCCGTCC-3 235bpNM003255TIMP3F5 -GATGGCAAAAGCAAAACAAAATG-3 R5 -GACAGCAGACTGGCTAAAGGGA-3 175bpNM000362TIMP4F5 -CTGCCAAATCACCACCTGCTAC-3 R5 -GCTGAACGATGTCAACAAACTCCT-3 200bpNM003256MMP3F5 -GCCATCTCTTCCTTCAGGCG-3 R5 -TCACGGTTGGAGGGAAACCT-3 158bpNM_002422MMP9F5 -TCTACACCCAGGACGGCAAT-3 R5 -GAAGCCGAAGAGCTTGTCCC-3 158bpNM004994MMP2F5 -CGGAAAGATGTGGTGTGCGA-3 R5 -GTCATCCTGGGACAGACGGA-3 202bpNM_001302510NQO-1F5 -AAGCCGCAGACCTTGTGATA-3 R5 -TGGCAGCGTAAGTGTAAGCA-3 117bpNM_00090HO-1F5 -CAGTGCCACCAAGTTCAAGC-3 R5 -CTGGATGTTGAGCAGGAACG-3 118bpNM_002133
1.4 胶原含量检测
收集的细胞培养液上清经离心去沉淀后直接用于胞外胶原含量检测；细胞经PBS清洗后，加入适量体积的RIPA裂解液(含体积分数1%磷酸酶抑制剂和体积分数1% 蛋白酶抑制剂)，冰上裂解10 min，12 000 g离心10 min，取上清检测胞内胶原含量。
使用BCA试剂盒对待测样本中的总蛋白进行定量。采用人总胶原ELISA试剂盒(酶免，上海)检测样本中总胶原含量的变化，按照试剂盒说明书检测450 nm波长处OD值的变化，根据标准曲线计算样本中总胶原的含量。采用Western blot 法检测胞内I 型胶原的表达，20 μg总蛋白通过8% SDS-PAGE电泳分离，并转移至PVDF膜(Millipore，美国)。将膜放置于质量浓度为5%脱脂奶粉中，室温条件下进行封闭处理2 h，分别加入鼠抗人Collagen I抗体和GAPDH抗体(1∶500)(Servicebio，武汉)，4 ℃孵育过夜。一抗孵育结束后加入HRP偶联的羊抗鼠二抗(1∶5 000)(Servicebio，武汉)，室温孵育1 h.漂洗后使用ECL发光试剂盒显影，采用ImageJ分析软件对蛋白条带进行灰度值分析，以GAPDH为内参，比较乙酰唑胺处理前后圆锥角膜成纤维细胞中I型胶原的表达。
1.5 细胞内氧化应激水平检测
乙酰唑胺处理后，采用活性氧(ROS)荧光探针DCFH-DA(10 μmol/L)孵育圆锥角膜成纤维细胞，通过荧光倒置显微镜成像，使用 ImageJ 1.8.0 软件对荧光强度进行定量，分析乙酰唑胺处理后细胞内 ROS 含量变化。收集乙酰唑胺处理后的细胞，通过反复冻融裂解细胞，取上清，BCA法蛋白定量后采用丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(索莱宝，北京)和总氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(普利莱，北京)检测细胞内 MDA 含量和T-AOC的变化。
1.6 数据分析
每组实验重复3次(n=3)，使用 SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析，p<0.05认为在统计学上有显著性差异。
2 实验结果
2.1 乙酰唑胺调节圆锥角膜成纤维细胞胶原代谢相关基因的表达
为了探讨乙酰唑胺类药物在圆锥角膜成纤维细胞基质重塑过程中的作用，本研究通过qPCR分析了乙酰唑胺处理后圆锥角膜成纤维细胞胶原蛋白合成和降解相关基因的表达变化。结果如图1所示，与对照组相比，乙酰唑胺处理组中COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1等胶原合成基因的表达显著上调(图2(a)，p<0.05).脯氨酰 4-羟化酶(P4H)和前胶原赖氨酸2-氧代戊二酸5-双加氧酶(PLOD)参与脯氨酰和赖氨酰残基的羟基化修饰，在胶原蛋白组装、成熟过程中起重要作用。乙酰唑胺处理后，圆锥角膜成纤维细胞中胶原羟基化修饰基因P4HA、P4HB和PLOD2、PLOD3的表达没有显著变化(图2(b)、(c))，而参与胶原交联的赖氨酰氧化酶基因LOX3、LOX4的表达显著升高(图2(d)，p<0.05).基质金属蛋白酶(MMP)及其组织抑制因子(TIMP)参与胶原的降解，相较对照组，乙酰唑胺处理组中MMP2、MMP3、MMP9的表达显著下降(图2(e)，p<0.05)，TIMP1、TIMP2、TIMP4的表达显著上调(图2(f)，p<0.05).
图1 乙酰唑胺处理后圆锥角膜成纤维细胞内胶原合成和降解相关基因的表达变化
Fig.1 Expression of genes related to collagen synthesis and degradation in acetazolamide treated keratoconus cells
图2 乙酰唑胺处理后圆锥角膜成纤维细胞中胶原含量变化
Fig.2 Changes of collagen content in keratoconus fibroblasts after acetazolamide treatment
2.2 乙酰唑胺提高圆锥角膜成纤维细胞中胶原蛋白的含量
采用ELISA方法分析乙酰唑胺处理后胞内外总胶原含量的变化，结果显示，乙酰唑胺处理24 h后圆锥角膜成纤维细胞培养液上清及胞内总胶原含量均显著增加(图2(a)，p<0.05).I型胶原是角膜细胞外基质的主要成分，采用Western blot 进一步检测I型胶原的表达变化，如图2(b)所示，乙酰唑胺处理后圆锥角膜成纤维细胞中 I 型胶原蛋白表达为对照组的 5 倍(p<0.05).
2.3 乙酰唑胺抑制圆锥角膜成纤维细胞内氧化应激水平
为深入探究乙酰唑胺调节圆锥角膜成纤维细胞中胶原合成的机制，本研究进一步分析了乙酰唑胺处理后细胞内氧化应激水平的变化。如图3所示，乙酰唑胺处理后，角膜成纤维细胞中ROS水平显著降低(p<0.05).进一步检测氧化应激标记物MDA 含量和细胞总抗氧化能力、抗氧化酶表达的变化，结果发现，乙酰唑胺处理后，胞内 MDA 含量下降(图4(a))，细胞总抗氧化能力提高(图4(b))，抗氧化酶基因NQO-1的表达显著升高(图4(c))(p<0.05).
图3 乙酰唑胺处理后圆锥角膜成纤维细胞内ROS含量变化
Fig.3 ROS level in acetazolamide-treated keratoconus fibroblasts
图4 乙酰唑胺处理后圆锥角膜成纤维细胞内MDA含量、总抗氧化能力及抗氧化酶基因表达的变化
Fig.4 MDA content，T-AOC，and gene expression of antioxidant enzymes in acetazolamide-treated keratoconus fibroblasts
3 讨论
探索能从根本上改善胶原降解、增强角膜力学性能的方法，对减缓圆锥角膜进程、治疗圆锥角膜具有重要意义。目前，临床上晚期圆锥角膜患者不得不进行角膜移植术，早中期圆锥角膜的治疗手段仍主要依赖佩戴角膜接触镜，胶原交联治疗圆锥角膜仍在探索改进中，尚无药物治疗圆锥角膜的报道。研究发现，乳铁蛋白能够保护人角膜上皮细胞免受氧化应激损伤，可用于治疗氧化应激导致的眼部疾病[16]。萝卜硫素能够激活兔角膜组织中Nrf-2/HO-1抗氧化信号途径，减缓圆锥角膜的进展[10]。本研究发现乙酰唑胺可以调节角膜细胞氧化应激水平，增加圆锥角膜I型胶原及交联蛋白的表达，下调MMPs表达，降低圆锥角膜细胞外基质的降解。
胶原是角膜细胞外基质的主要成分，胶原的含量和结构对角膜的结构和功能维持具有重要作用[17]。胶原合成和降解失衡，形态和排列发生改变，能够导致角膜抗变形能力降低、生物力学性能下降，进而诱导圆锥角膜的发生。已有研究表明，圆锥角膜患者的眼泪中胶原降解酶MMPs 的表达提高，胶原降解产物增加[2]。转录组测序结果发现，圆锥角膜中COL5、COL6、COL12等胶原合成基因的表达下调，胶原羟基化修饰基因P4Hs、PLODs 及交联基因LOXs 的表达降低[5，7，18]。蛋白组学分析结果显示，与正常角膜相比，圆锥角膜中I 型、 III 型胶原等细胞外基质蛋白含量显著降低[3]。qPCR 结果显示，圆锥角膜细胞中 COL1的表达降低[19]。上述已有研究表明，圆锥角膜中胶原合成及羟基化修饰基因表达降低，胶原降解增加，胶原含量减少。本研究结果显示，乙酰唑胺处理后圆锥角膜成纤维细胞中编码I、III、V、VI胶原基因及胶原交联酶基因LOXs的表达升高，胶原降解蛋白基因MMPs的表达下降，胶原修饰基因 P4Hs、PLODs的表达没有显著变化。 I 型胶原是角膜细胞外基质的主要成分，占总胶原蛋白的 60%[20].进一步分析结果显示，乙酰唑胺处理后圆锥角膜成纤维细胞中I型胶原含量降低。本研究结果表明，乙酰唑胺能够促进圆锥角膜细胞中胶原的合成和交联，减少其降解。
氧化应激参与多种眼部疾病的发生，在圆锥角膜的发病过程中发挥重要的作用[21-22]。对文献报道的圆锥角膜中的氧化应激标志物进行系统分析，结果发现与健康对照组相比，圆锥角膜中ROS以及MDA含量显著增加，总抗氧化能力降低，氧化-抗氧化稳态失衡[23]。氧化应激可以通过调节细胞外基质重塑参与多种疾病的发生。对癌细胞的研究表明，H2O2可以通过下游的MAPK途径、PI3K途径激活MMPs[24].ROS能够通过NF-κB信号途径诱导大鼠脑星形胶质细胞MMP9的表达[25]。在肾脏组织中，ROS可通过TGF-β1通路调节胶原的合成和降解[26]。对肺动脉平滑肌细胞的研究发现，乙酰唑胺可以减弱由缺氧诱导产生的活性氧[27]，推测乙酰唑胺可能通过调节氧化应激水平发挥作用。本研究发现乙酰唑胺处理后，圆锥角膜成纤维细胞中氧化应激标记物含量减少，抗氧化酶表达及细胞总抗氧化能力升高，表明乙酰唑胺能够降低圆锥角膜成纤维细胞中氧化应激水平，进而通过氧化应激介导的信号途径调节胶原的代谢。
角膜组织与其他结缔组织不同，需要保持透明。圆锥角膜治疗除了要考虑改善胶原蛋白含量及交联程度，还要避免瘢痕的形成。III型胶原是瘢痕组织主要表达的胶原蛋白，虽然本研究发现乙酰唑胺能改善圆锥角膜成纤维细胞I型胶原的表达，诱导III型胶原亚基编码基因的表达，但是否会影响III型胶原的含量还不明确。鉴于此，后续实验将进一步考量乙酰唑胺对III型胶原等调节角膜透明度的蛋白或蛋白多糖含量的影响，以及对角膜组织力学性能的作用，为该类药物改善圆锥角膜发展进一步提供实验依据。
综上所述，乙酰唑胺能够通过调节氧化应激水平，增强细胞抗氧化能力，减少氧化损伤，进而诱导圆锥角膜成纤维细胞胶原的合成，抑制胶原降解。本研究结果可为圆锥角膜的治疗提供新思路。
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