化疗是癌症治疗的重要手段。阿霉素是临床上常用的广谱化疗药物。由于其水溶性差、非靶向性以及用药导致的心脏毒性[1]，所以将阿霉素靶向运输到病灶区域对于提高阿霉素的治疗效率以及减轻副作用具有重要意义[2-5]。基于纳米载药技术的阿霉素(doxorubicin，DOX)输运增强了机体内阿霉素在靶向区域的吸收和分布，提高了杀伤癌细胞的能力，减少了药物对于正常组织的不良反应[6-9]。载有DOX的聚合物-脂质混合纳米粒子(polymer-lipid hybrid nanoparticle，PLN)比游离的DOX更容易向细胞内进行转运[10]。基于TiO2纳米颗粒的DOX运输可以使得MCF-7细胞中药物积累量增加约2.4倍[11]。Ge-DOX-5-ALA/NPs纳米颗粒可以利用肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)触发释放药物，以成功地将DOX转运到肿瘤部位[12]。复杂的肿瘤微环境对于阿霉素的靶向运输有着显著影响。包裹于乙二醇壳聚糖上的阿霉素的输运受到微环境酸碱度的影响，当pH值为5时靶向区域处释放出来阿霉素的荧光强度最大[13]。缺铁微环境中影响基于聚乙烯醇的DOX输运，当加入转铁蛋白配体之后，肿瘤细胞对于载药颗粒的摄取率显著提高[14]。因此，研究复杂肿瘤微环境对于改善化疗效果有重要意义。
在众多肿瘤微环境因素中，肿瘤力学微环境(例如细胞外基质刚度)对于肿瘤发展进程以及治疗有着重要影响。转移性癌细胞的细胞外基质与正常组织的细胞外基质刚度相比显著降低[15-16]。基质中胶原蛋白水平的增加导致的肿瘤内血管受压和灌注不足使得到达肿瘤部位的化疗药物浓度降低[17]。致密性的基质阻碍了较大尺寸(>60 nm)的纳米载药颗粒输运到肿瘤处进而影响治疗效果[18]。在特定刚度的基质中紫杉醇更容易被乳腺癌细胞吸收[19-21]。在刚度为105 kPa的基质中肝癌细胞对于顺铂的耐药性最强[22]。针对于在肿瘤发展进程中伴随的基质刚度变化的研究能够为提高化疗药物利用效率提供潜在帮助。
包裹于载药颗粒上的化疗药物向内输运的效率与细胞的内吞作用有关。已有研究表明基质刚度对于细胞内吞作用有调控作用。较硬的基质会抑制MK2抑制剂肽的吸收[23]。基底刚度的增加会使得单位面积上的乳腺癌细胞对于载有药物C6的F127MM纳米颗粒的摄取效率降低[24]。软基质上培养的MCF-7细胞显着提高了对于细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的吸收[25]。基质刚度能够影响基质细胞对于癌细胞膜释放的微泡(microvesicles，MVs)的吸收效率[26]。由此看来，研究细胞外基质刚度对细胞内吞作用的影响有助于提高基于纳米载药技术的药物利用率，进而增强化疗药物的治疗效果。
在本研究中，探索了细胞黏附基底刚度对于基于纳米载药颗粒技术的阿霉素内吞作用的影响。具体内容有：1)探索了包裹在纳米载药颗粒上的DOX的输运对于不同PDMS基底刚度上的Hela细胞存活率的影响。2)研究了基底刚度对HeLa细胞中网格蛋白介导的内吞作用的影响。聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)纳米粒子可以负载抗癌药物DOX并通过内吞作用进入细胞。通过HeLa细胞吸收DOX的效率分析了底物刚度介导内吞作用的机制。检测HeLa细胞的活性和介导内吞作用的整合素αVβ5和蛋白NUMB在不同刚度的PDMS基底上表达。本工作发现ECM刚度的变化会影响细胞的内吞作用，合适的刚度(杨氏模量范围在0.578 MPa～1.986 MPa)可以使纳米载药达到更显着的治疗肿瘤效果。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
PDMS(基料、固化剂)购自Dow Corning公司(美国)；DMEM培养基和FBS胎牛血清购自Gibco公司(美国)；CCK8检测试剂盒购自Dojindo公司(日本)；盐酸氯丙嗪(内吞抑制剂CPZ)；DOX阿霉素购自MedChemExpress公司(中国)；一抗Anti-Integrin alpha V+beta5(1∶200)、NUMB单克隆抗体(1∶100)和二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)购自abcam公司(美国)；一抗NUMB多克隆抗体购自Thermo-Fisher公司(美国)；二抗Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG(H+L)、Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)、β-肌动蛋白-HRP兔单克隆抗体、DAPI和BCA蛋白定量试剂盒购于碧云天公司(中国)。
1.2 载药纳米颗粒和不同刚度的PDMS基底制备与力学性能测试
制备了聚乙烯吡咯烷酮PVP纳米粒子以携带DOX.先将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与葡萄糖在160 ℃混合制备CTAB-C，再将CTAB-C与30 mL丙酮在油浴中混合得到脱模板的C(RC)纳米材料，加入酒精通过超声波合成W18O49@RC，最后将PVP和W18O49@RC均匀分散在酒精中，充分搅拌并离心得到PVP-W18O49@RC纳米颗粒。制备的载药纳米颗粒显示出了良好的生物兼容性。具体细节见文献[27].
实验中使用了5种不同刚度的PDMS.先将PDMS基料与固化剂分别按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶30的质量比混合在6孔板中，再用真空干燥箱除去微小气泡，最后放入80 ℃烘箱中固化。采用电子机械仪测量了PDMS基底的杨氏模量。电子机械仪负载速度为100 mm/min，最大载荷为50 N.
1.3 PVP纳米颗粒和PDMS上的DOX负载
将1 mg PVP纳米颗粒和1 mmol/L DOX溶液分别分散于超纳米纯蒸馏水(1 mL)中，再将上述溶液混合在室温下暗区搅拌。将载有DOX的纳米粒子离心并用超纳米纯蒸馏水进行洗涤，每一次都收集DOX上清液以测量DOX的载量。用紫外-可见分光光度计测量加载后的上清液DOX溶液。公式(1)用于计算DOX的负载[28]。
(1)
其中,amount of loaded drug是指加载到PVP纳米颗粒上的DOX量。
将DOX溶于1 mmol/L的PBS溶液中，用DMEM稀释10倍至终浓度为100 μmol/L.将3 mL浓度为100 μmol/L的DOX溶液加入不同组别的PDMS中，浸泡48 h.用紫外-可见分光光度计测定培养基上清液的紫外吸收光谱。
1.4 细胞培养
研究中使用了人宫颈癌细胞系(HeLa；ATCC编号为CCL-2).HeLa细胞培养于DMEM培养基中，置于37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养。将5种不同硬度的PDMS基底进行消毒后，再将细胞溶液移入5组基底中，孵育48 h.
1.5 PDMS和内吞抑制剂CPZ的细胞毒性
PMDS和CPZ的细胞毒性通过CCK-8试剂盒表征。5组PDMS底物和对照组上的HeLa细胞密度均为105/mL.37 ℃培养48 h后，一组加入内吞抑制剂CPZ，37 ℃再培养1 h，后加入2 mL的50 μg/mL DOX或PVP/DOX培养18 h.将200 μL CCK-8溶液加入到含有2 mL培养基的每个培养皿中。将细胞在37 ℃下进行孵育。使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。每次测量重复3次。
1.6 PVP/DOX复合物的细胞摄取
DOX具有红色荧光特性。为了定位DOX，使用荧光显微镜进行标记。为了方便显微分析，将HeLa细胞接种在具有不同硬度PDMS的24孔板中，保证每孔约105个细胞，并置于37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中培养48 h.一组用PVP/DOX复合物(50 μg/mL)处理18 h，另一组细胞先用CPZ(25 μg/mL)处理1 h，然后加入PVP/DOX处理18 h.荧光显微镜观察前，用PBS洗涤细胞以除去游离的DOX.用ImageJ软件分析每个基板上细胞的荧光强度。
1.7 免疫荧光染色
整合素αVβ5和网格蛋白衔接蛋白NUMB是网格蛋白依赖性内吞作用中的两种重要蛋白质。本研究探测了接种在不同刚度PDMS基质上的细胞αVβ5和NUMB的形态。向HeLa细胞中加入体积分数1%BSA，37 ℃孵育30 min.再将体积分数1% BSA稀释的一抗Anti-Integrin alpha V+beta5(1∶200)和NUMB单克隆抗体(1∶100)加入细胞溶液中，并在4 ℃下保持过夜。用PBS(1∶500)稀释的二抗Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG(H+L)和Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)加入细胞溶液中并维持4 h.然后使用DAPI染色细胞核。最后将染色的细胞洗涤并在荧光显微镜下观察。使用ImageJ软件分析每个基板上细胞的荧光强度。对于每个基板，分析不少于100个细胞的至少5个区域。每个区域分析3次并取平均值以减少错误。
1.8 Western Blot检测蛋白质表达
将培养的细胞进行裂解。裂解物在冰上孵育，再在4 ℃、15 000 g下离心以收集上清液。参照BCA蛋白定量试剂盒说明书，测定各组蛋白浓度。上样等量蛋白，体积分数10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用含有0.2%吐温-20和5%脱脂奶粉的PBS封闭，并用兔单克隆抗NUMB抗体(1∶1 000)和抗β-肌动蛋白(1∶2 000)印迹过夜。用PBS洗膜，将蛋白质与山羊抗兔IgG H&L(HRP)和β-肌动蛋白-HRP兔单克隆抗体(1∶5 000) 室温孵育1 h.使用蛋白质印迹数字成像仪对条带进行可视化。
1.9 统计分析
所有定量结果均以平均值±标准差(SD)表示，在Origin软件中采用Tukey显著性检验评价组间差异。*表示两组数据存在差异(*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001)，0.05表示显著差异，N.S表示无显著差异。所有生物学实验均重复3次。
2 结果和讨论
2.1 PDMS基底的刚度特性
通过拉伸试验测试了5种配比的PDMS基底力学性能，PDMS的应力-应变曲线如图1(a)所示。通过拟合曲线前10%的斜率得到了不同质量比的PDMS的杨氏模量(图1(b))。结果表明，调控PDMS配比能够影响其力学性能，抗拉强度会随着质量比的增加而增加。质量比为1∶30的PDMS最软，杨氏模量为0.447 MPa，而质量比为1∶5的PDMS刚度最大，杨氏模量为2.38 MPa.质量比为1∶20，1∶15和1∶10的PDMS杨氏模量分别为0.578 MPa，0.815 MPa和1.986 MPa.
图1 不同质量比PDMS基材的冷拉伸性能
Fig.1 Cold-drawn tensile properties of PDMS substrates with different mass ratios
2.2 不同刚度PDMS的DOX负载能力
采用紫外-可见分光光度计测量了不同配比的PDMS基底上DOX的吸附特性。分别测定DOX溶液，DMEM溶液以及各组不同刚度PDMS基底负载DOX 48 h后上清液的紫外吸收光谱特性。不同组别的吸光度曲线如图2所示。DOX在480 nm处表现为强吸收峰，这与文献[29]结果相类似。DMEM在430 nm处表现为强吸收峰。而各组PDMS基底上的DOX负载能力没有明显的差异，这说明不同刚度的PDMS基底不会影响游离的DOX负载能力。
图2 负载DOX 48 h后不同组的紫外吸收特性曲线
Fig.2 UV absorption characteristic curve of different groups after loading DOX for 48 h
2.3 PVP纳米粒子的DOX负载能力
将PVP纳米颗粒加到DOX溶液中磁性搅拌48 h，然后吸出上清液进行紫外-可见分光光度法测定。如图3所示，DOX和载药后PVP/DOX复合物的紫外吸收光谱分别以红线和蓝线表示。DOX和PVP/DOX复合物的吸收光谱在480 nm处有明显的吸收带，但PVP/DOX复合物的吸收光谱强度大大低于纯DOX溶液，这是由于药物已被加载到PVP粒子上。根据式(1)计算得出，PVP粒子的载药量约为100 μmol/L.
图3 采用紫外-可见分光光度法测定DOX在PVP颗粒上的负载能力
Fig.3 Loading capacity of DOX on PVP particles measured by UV-vis spectrophotometry
2.4 DOX的细胞内摄取和分布
为了评估PVP在细胞内的摄取情况并证明PVP纳米颗粒可以通过特定的内吞途径被内化到靶细胞中，研究了PVP/DOX复合物在HeLa细胞中的内吞行为和内吞途径。在正常条件和内吞抑制条件下，通过荧光倒置显微镜监测DOX的红色荧光来定位不同刚度的PDMS基质上培养的细胞中PVP/DOX颗粒。在药物孵育18 h后，对照组和不同刚度PDMS基底上DOX的大部分红色荧光均匀分布在细胞内，少量DOX分布在细胞膜周围；而在先用抑制剂CPZ预处理1 h再孵育药物后，各组细胞膜外而不是细胞内出现鲜红色荧光(图4).结合两组实验分析，PVP纳米粒子可以被细胞内化吸收，并通过网格蛋白介导的内吞途径被细胞有效吸收。
图4 网格蛋白内吞抑制剂(CPZ)改变了载药纳米颗粒在HeLa细胞内的内化吸收，加入抑制剂后DOX荧光在细胞膜边缘聚集
Fig.4 Clathrin endocytosis inhibitor(CPZ) changing the internalization absorption of drug-loading nanoparticles in HeLa cells，and DOX fluorescence assembled at the edge of cell membrane after adding the inhibitor
2.5 药物和内吞抑制剂影响细胞活性
为了探究基底刚度对内吞作用的影响，第一组加入游离DOX培养18 h，第二组先加入内吞抑制剂CPZ，然后加入PVP/DOX复合物培养18 h，第三组不加抑制剂，直接加入PVP/DOX复合物培养18 h.3组CCK-8结果如图5所示。发现在不加入DOX的情况下，不同刚度的PDMS基底对细胞生长没有影响。在仅添加游离DOX的条件下，可以看到DOX对细胞有一定的杀伤作用，但不同刚度组仍没有表现出明显差异。对加入PVP/DOX复合物的两组数据进行分析后发现，与仅添加游离DOX组对比，添加内吞抑制剂组细胞活性增加，而未添加内吞抑制剂组细胞活性显着降低，不同刚度组间存在统计学差异。质量比为1∶10、1∶15和1∶20的PDMS基底上的细胞活性低于质量比为1∶5和1∶30的PDMS基底上的，这说明较硬和较软的基底不利于细胞的内吞作用，从而减少了PVP/DOX颗粒扩散进入细胞，而中等刚度的基底有利于纳米颗粒进入细胞。因此，适当的基底刚度能够提高纳米颗粒的给药效率，这在给药系统的实际应用中起着重要的作用。
图5 分别添加游离DOX、细胞内吞抑制剂CPZ和PVP/DOX、PVP/DOX的不同刚度PBMS基底对Hela细胞活力的影响
Fig.5 Effects of PBMS substrate with different hardness on Hela cell viability by adding free DOX，endophage inhibitors CPZ, and PVP/DOX，PVP/DOX
2.6 整合素αVβ5和衔接蛋白NUMB分布和强度的变化
免疫荧光染色用于表征在不同基质上培养的HeLa细胞的细胞核(DAPI，蓝色通道)、整合素(αVβ5，绿色通道)和网格蛋白衔接蛋白(NUMB，红色通道)的共定位(图 6).最近的研究表明，整合素αVβ5位于网格蛋白介导的内吞结构中，可以更好地将网格蛋白锚定在底物上，促进内吞作用[30-31]。内吞过程中，NUMB充当网格蛋白衔接蛋白，将网格蛋白与整合素连接来引导内吞[32-34]。如图6所示，各组整合素αVβ5蛋白分布无明显变化，但在对照组和1∶10、1∶15、1∶20的PDMS底物上可观察到NUMB蛋白的高亮簇分布与其他组不同。
图6 不同基底刚度对αVβ5和NUMB表达的影响
Fig.6 Effects of different substrate stiffness on the expression of αVβ5 and NUMB
图7荧光定量分析表明整合素αVβ5在1∶10 PDMS基底上的表达较高，NUMB蛋白在3种中等刚度基底上的表达显著高于其他组，且NUMB蛋白在1∶15 PDMS基底上具有最高的荧光强度。结合2.5节中的结果，可得知两种蛋白的高表达,尤其是NUMB，促进了网格蛋白介导的内吞作用，从而增加了载药纳米粒进入细胞的能力，增强了药物对癌细胞的杀伤作用。
图7 HeLa细胞内吞蛋白整合素αVβ5和NUMB表达的定量分析
Fig.7 Quantitative analysis of HeLa cell endocytosis protein integrin αVβ5and NUMB expression
2.7 NUMB蛋白表达的定量分析
为了进一步评估基底刚度对HeLa细胞内吞途径的影响，以β-actin(42 ku)为内参蛋白，采用Western blot探索网格蛋白衔接蛋白NUMB(72 ku)在不同底物中的活化和表达情况。Western blot结果如图8(a)所示，图8(b)显示了蛋白质条带的归一化数据。与免疫荧光染色结果类似，Western blot显示NUMB蛋白在质量比为1∶15 PDMS基底上的表达水平最高，比对照组高近1.5倍(图8(b)).除此之外，NUMB蛋白在质量比为1∶20 PDMS基底上的表达水平也高于对照组，而1∶5和1∶30的数据最低。这些结果与细胞活性测试一致，表明在特定刚度的基底上NUMB的蛋白表达水平发生变化，这可能是不同刚度基底上网格蛋白介导的内吞作用发生变化的原因。因此，基底刚度可用于调节NUMB蛋白的表达以抑制或促进 HeLa细胞的内吞作用。
图8 不同刚度底物对HeLa细胞内吞途径中的NUMB蛋白的影响
Fig.8 Effects of different stiffness substrates on NUMB proteins in the endocytic pathway of HeLa cells
3 结论
细胞的内吞作用可作为研究纳米载药治疗肿瘤的一个关键步骤，而细胞和基底之间的相互作用可能会影响细胞内吞作用的效率。在研究中，以HeLa细胞为研究对象，研究了5种不同刚度的PDMS基底如何调节HeLa细胞的阿霉素内吞行为。实验结果显示PDMS基底刚度的变化对于阿霉素的负载能力无影响，表明刚度调节下的HeLa细胞的活性改变与初始阿霉素浓度无关。纳米颗粒介导的阿霉素的内吞行为受基底刚度调控，在刚度为0.578 MPa，0.815 MPa和1.986 MPa基底上呈现出胞内阿霉素浓度高以及细胞活性差。通过免疫荧光染色和Western Blot实验发现，与内吞作用相关的整合素αVβ5，衔接蛋白NUMB蛋白表达的变化受基底刚度的调控，使得阿霉素的内吞效率变化，进而影响阿霉素杀伤肿瘤细胞的效果。刚度调控的αVβ5和NUMB表达的升高促进了胞内阿霉素浓度的提高，与HeLa细胞活性变差的结果一致。该研究为优化纳米载药材料以实现更高疗效提供了潜在基础，并为更好的癌症治疗提供了有用的视角。
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