压疮(压力性溃疡)在临床上常病发于中风或昏迷而卧床的病人，尤其是截瘫患者，主要是由长期内源性压力引发局部皮肤组织缺血、坏死所致，其中1/3[1]压疮均位于骶尾部。骶尾部及坐骨结节处的压疮外口小、创底大，深部组织损伤严重，潜在坏死范围大于表面所见，其可累及皮肤、皮下组织、肌肉、肌腱甚至深达骨质，且常合并慢性感染[2]，据报道全世界每年约有6万人死于压疮合并症[3]。现今有很多类型的重建手术可为一期扩创后的大面积、大体积的空腔提供其所需皮肤的覆盖，以及软组织的填充[2]，传统的局部皮瓣和臀大肌皮瓣转移修复压疮，为治愈相对表浅的压疮提供了一种切实可靠的方法；而对于深度压疮，由于其填充效果并不理想，受压摩擦后易再发，已经成为一个全球性迫切需要解决的医疗健康问题[4]。
国际NPUAP-EPUAP压疮分级为：Ⅰ期，皮肤完整，局部有压之不褪色的局限性红斑，多出现在骨隆突处；Ⅱ期，真皮部分出现缺失；Ⅲ期，全层皮肤组织缺失；Ⅳ期，组织全层缺失，合并有骨、肌肉或肌腱外露，焦痂或腐肉可以出现在创面的某些部位，常常合并有隧道或者潜行出现。深度压疮是指压疮分期中的Ⅲ期和Ⅳ期压疮，即压疮的溃疡期，深度压疮的特点是全层皮肤破坏，坏死组织深达皮下组织和深层肌肉组织，伴有严重的感染，甚至向周边及深部扩展，累及骨面。为消灭深度压疮形成的“窟窿”最好的办法无非是填充“窟窿”，而填充压疮“窟窿”最佳办法无非是软组织[5]。
临床上应用的填充材料主要包括非生物性材料和生物性材料两大类[6]。由于后者植入体内后具有一定的组织和细胞生长诱导作用和自身塑形作用，因此生物性填充材料的开发和应用成为近年来研究的热点[7-10]。目前临床应用中的4个常用领域，包括最为典型的慢性创面糖尿病足溃疡，整形外科领域的乳房重建，普通外科领域的腹部皮肤缺损修复，口腔颌面外科的组织缺损重建修复[11]。
在众多的生物软组织填充材料中，脱细胞真皮基质是近年来的研究热点之一，由于脱细胞真皮基质去除了抗原性很强的细胞成分，保留了抗原性相对较弱的细胞外基质成分，从而可避免移植后的急性排斥反应。在结构上保留了天然真皮的基本框架，更接近于正常真皮结构，很适合作为生物软组织填充材料修复临床上常见的凹陷性组织缺损。同种异体真皮脱细胞基质取自异体皮，而异体皮多取自保存完好的尸体皮，其来源十分有限，且存在传染疾病的危险，同时受到伦理学的制约，其应用受到极大的限制。异种脱细胞真皮的应用存在以下缺陷：①较强的免疫原性；②血管化速度缓慢；③潜在异源性病毒微生物感染风险[12]。因此，本文采用临床健康人体包皮环切术的标本脱细胞进行后续研究。
本文根据前期研究，确立了一套完善的物理方法、胰酶消化法和洗涤剂漂洗的真皮脱细胞制备工艺。但是，该脱细胞工艺对真皮结构及生物学特性影响尚未了解，本研究拟对此问题深入研究，检测该工艺制备的脱细胞真皮基质的物理结构及力学特性，采用体外培养方法验证其生物相容性，为其应用于压疮治疗提供理论依据。
1 实验材料与方法
1.1 脱细胞基质的制备
研究项目经伦理委员会批准，研究中涉及到的人体组织为包皮环切手术所切下的正常组织，组织来源于无传染性疾病的患者，患者及家属对实验知情并同意。取样后用生理盐水冲洗，碘伏消毒，使用含质量分数1%的青霉素及链霉素的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)浸润消毒30 min，PBS洗3遍，去除皮肤的皮下组织，为对照组。对照组再采用γ射线对其灭菌，质量分数0.05%Trypsin酶/EDTA在37 ℃脱细胞24 h，在摇床上使用含质量分数1%的青霉素及链霉素的PBS制备脱细胞基质。
1.2 基质内部特性检测
扫描电镜(scanning electron microscope，SEM，JSM-7100F，Jeol日本)观察两组材料真皮内部结构。将两组(n=3)材料用0.01 mol/L的PBS(pH=7.4)洗涤30 min后，用质量分数2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定，0.01 mol/L PBS(pH=7.4)浸洗2次，每次5 min；分别用体积分数50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各5 min，质量分数100%乙醇脱水3次，每次5 min；之后冷冻干燥样品，真空喷金，扫描电镜观察，拍照。原子力显微镜(Atomic force microscopy，AFM，L01K180，BRUKE德国)观察两组材料真皮表面微区结构。使用一个探针(模型NCHV，BRUKER，UA)和1 Hz表面扫描频率在轻敲模式下成像，扫描两组(n=3)材料表面。扫描面尺寸为10 μm×10 μm，并使用Nanoscope软件对结果进行评估。
排乙醇称重法测孔隙率。取基质(n=3)，冷冻干燥。每个支架干燥后称重记为m1，置入50 mL含体积分数75%的乙醇离心管。抽真空至不再有气泡溢出，称含有乙醇和支架材料离心管m2，将含有乙醇的支架材料取出，称剩余的乙醇及离心管m3.按式(1)计算孔隙率P[13]：
(1)
材料的表观密度。取基质(n=3)，冷冻干燥。将支架做成矩形，用游标卡尺测定支架材料的长a、宽b和厚度H，每份样品重复操作3次，取平均值。用电子天平称量支架材料的重量m，则材料的表观密度ρ按式(2)计算：
(2)
1.3 基质生物力学压缩弹性模量测量
压痕法表征基质真皮面生物力学压缩性能。将各组材料剪成1 cm×1 cm大小，使用Instron5544万能试验机(Instron5544，英斯特朗上海材料试验机公司)钢针直径为1 mm，设置下降速率为1 mm/min，检测支架压缩弹性模量。按文献[14]报道的模型对实验获得的载荷-位移曲线进行分析，按照式(3)计算获得皮肤的整体刚度。
(3)
式中：F表示载荷，E表示皮肤的整体刚度，r表示探针半径，s表示位移，ν表示泊松比。结束条件为应变达到80%.
1.4 生物学特性验证
HE常规染色观察真皮基质中细胞成分脱除效果。真皮基质表面接种能稳定表达荧光Lifeact的细胞株24 h、48 h后使用倒置荧光显微镜观察细胞在基质表面的黏附情况，并拍照。分别取真皮基质(n=3)置于24孔板中，用于检测1 d、4 d、7 d的细胞量，HFB接种密度为2.25×104个/孔，另设9个无基质对照孔，按CCK-8(碧云天，上海)说明书分别检测1 d、4 d、7 d吸光度值观察细胞的增殖情况。其中CCK-8孵育1 h，酶标仪上在450 nm处检测培养液的吸光度值。按式(4)计算细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR)，根据《非直接接触血液的医用生物材料生物性能测试标准》6级毒性分级法评定脱细胞真皮基质材料的细胞毒性，评级≥2级则判定材料存在细胞毒性。
(4)
细胞长入情况。取真皮基质(n=6)于6孔板，HFB接种密度为1×104个/孔，培养体积分数10%胎牛血清的DMEM培养细胞3 d后，将其中3个基质从中间剖开(示意简图见图1)，多聚甲醛固定，DAPI(Sigma，美国)染色观察支架横截面细胞的分布；基质与HFB共培养9 d后，取出剩余3个基质从中间剖开，DAPI染色观察支架横截面细胞的分布。
图1 基质纵向横截面示意简图
Fig.1 Schematic diagram of longitudinal cross section of matrix
1.5 统计学方法
采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。定量数据采用均数±标准差，测试样本为3个，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基质内部结构
扫描电镜下可见脱细胞基质内部纤维与正常组织纤维相比损失了一部分，表现出缺损，如图2所示。
图2 SEM材料内部结构图
Fig.2 SEM images of material internal structure
对照组材料与基质的高度分别为(1 659.3±605.4)nm，(2 451.0±404.4)nm；粗糙度分别为(0.790±0.035)，(0.819±0.007).原子力显微镜检测支架表面100 μm2的面积内发现最高高度和粗糙度基质和正常组织相比无统计学意义，脱细胞处理没有改变基质的微观结构，结果如图3所示。
图3 两组材料表面微区高度及粗糙度
Fig.3 Height and roughness of microzone on the surface of the two groups of materials
材料孔隙率可反应材料内部的疏松程度。通过采用排乙醇称重法测量材料孔隙率，本文发现基质孔隙率为(86.7±2.1)%，相比对照组的孔隙率(59.2±9.9)%显著上升，P<0.05，结果如图4所示。
*表示与对照组相比，实验组显著性统计值P<0.05，
***表示P<0.001.
图4 两组材料孔隙率及表观密度
Fig.4 Void ratio and apparent density of two groups
通过检测，本文发现与对照组密度值(0.393±0.136)g/cm3相比，基质的密度值(0.099±0.020)g/cm3下降，这与细胞去除后留下空隙相关，说明基质材料疏松，结果如图4所示。
2.2 基质压缩弹性模量表征结果
材料压缩弹性模量表征材料抵抗弹性变形的能力，基质压缩弹性模量(12.59±5.50)MPa与对照组材料压缩弹性模量(6.75±2.20)MPa相比，差异无统计学意义(P>0.05)，即在压疮修复中受压时该基质抗压性能与正常皮肤无差异，结果如图5所示。
图5 各组材料压缩弹性模量
Fig.5 Elastic modulus in compression of each group
2.3 生物学特性表征结果
2.3.1HE染色和细胞黏附实验
HE染色可使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色，细胞质和细胞外基质中的成分着红色，两组材料HE染色结果如图6所示。对照组真皮中存在大量细胞，基质中基本无核酸成分，说明脱细胞效果较好。接种细胞24 h后，倒置荧光显微镜下发现在支架上细胞大多数呈圆形，20倍镜观察到有少数细胞黏附、铺展较完全，表现为细胞呈梭形；48 h后，低倍镜下看到有更多的细胞黏附在支架上，20倍镜观察到绝大部分细胞已完全铺展到支架上，呈梭形，如图7所示。
图6 两组材料HE染色图
Fig.6 HE staining of two groups of materials
图7 荧光细胞在支架表面的黏附
Fig.7 Adhesion of fluorescent cells on the surface of scaffold
2.3.2细胞毒性检测结果
把脱细胞真皮基质表面接种HFB后，仅为细胞和培养液的对照孔及基质周围细胞生长状况如图8所示，可观察到细胞长势基本无差异，至第7 d时，对照组基本铺满细胞，材料周边也基本铺满细胞，10倍物镜下基本呈线形排列。CCK-8检测细胞增殖检测结果如图9所示，细胞与基质共培养7 d细胞数量不断增加，表明脱细胞基质良好的生物相容性。根据《非直接接触血液的医用生物材料生物性能测试标准》6级毒性分级法评定脱细胞基质细胞毒性[11]，得到表1，判定该材料无细胞毒性。但对照组孔细胞增殖水平仍高于实验组，推测接种细胞数较多，基质占据一定的空间位置，而细胞又不容易从基质底部长入基质，空间因素的限制导致实验组细胞数量少于对照组。
图8 HFB在存在基质(实验组)与不存在基质(对照组)的生长
Fig.8 Growth of HFB in the presence (Experience group) and
without the presence (Control group)
图9 HFB不同时间CCK-8检测增殖结果
Fig.9 Proliferation of HFB detected by CCK-8
表1 材料组细胞相对增殖率及毒性评价
Table 1 Evaluation of cell relative proliferation rate and
toxicity in material group
细胞培养时间RGR基质毒性1 d86.2%1级4 d78.2%1级7 d84.1%1级
2.3.3细胞长入情况
基质表面接种细胞3 d后，从支架边缘沿厚度方向剖开，倒置荧光显微镜观察到纵向横截面沿厚度方向有大量蓝色细胞核的分布，细胞长入方向如红箭头所示，靠近支架边缘细胞较多(如图10所示)，且分布不均匀。基质表面接种细胞9 d后，纵向横截面基本充满均匀的蓝色细胞核。
图10 细胞在基质上的长入情况
Fig.10 Cell growth in matrix
3 讨论
脱细胞真皮基质去除了抗原性很强的细胞成分，保留了抗原性相对较弱的细胞外基质成分，从而可避免移植后的急性排斥反应[15]。在结构上保留了天然真皮的基本框架，更接近于正常真皮结构，且脱细胞真皮基质在体内会逐渐降解并被新生组织替代，成为在功能、形态上与周围正常组织一致或相似的自体组织。因此，脱细胞真皮基质可作为组织凹陷的良好充填物，可片状重叠充填，亦可双层、三层甚至更多层充填[16]。
目前脱细胞基质存在天然材料固有的缺点——力学性能较差，针对组织工程脱细胞真皮制备中存在的不足，研究组织工程真皮基质的制备方法及其特性能为临床治疗创面提供依据[17]。本文所使用的真皮来自健康人的包皮环切术的人体多余组织，术前会进行常规检查，相较异体尸体皮较安全，且此部位皮肤弹性优于人身体其他部位[18]，但将人体脱细胞真皮基质作为压疮填充物的研究鲜有报道。
细胞外基质衍生的生物支架是使用自上而下构建组织的，由经过处理的天然细胞外基质组成的生物支架已经被植入数百万人体内，应用范围从疝气治疗和肩部肩袖修复到乳房重建手术[9，19]。生物支架是通过杀死细胞并洗掉它们的残余物而形成的，留下组织细胞外基质，它是蛋白聚糖和蛋白质的复杂混合物，可以根据临床需要加工成植入物、可注射水凝胶或颗粒悬浮液，它们可在特定部位作为细胞迁移和新组织发育的支架[10]，本文中脱细胞基质与对照组相比，其相对增殖率判定该基质无细胞毒性作用，且体外培养9 d HFB可基本充满基质内部。因此，该真皮脱细胞基质可应用于压疮治疗中的组织填充物，为压疮周围正常细胞迁移提供附着位点，以便于新的皮肤组织的形成。
理想的组织填充材料必须具备以下条件[6]：1) 组织相容性好；2) 不致癌，不致畸；3) 与宿主有一定的结合能力；4) 无微生物、病毒或其他病原体存在；5) 无抗原性、不导致免疫及组织相关性疾病；6) 效果持久、可靠；7) 易于消毒、贮藏；8) 置入宿主体内后易于成形、塑形及固定。
本文脱细胞基质采用的γ射线[20-21]是常用的组织移植物灭菌方法，γ射线能使其他物质氧化或产生自由基(OH·H)再作用于生物分子，或者直接作用于生物分子，打断氢键、使双键氧化、破坏环状结构或使某些分子聚合等方式，破坏和改变生物大分子的结构，可有效抑制或杀死微生物[22]。本文采用的γ射线辐射的剂量为国际原子能机构(international atomic energy agency，IAEA)所建议的25 kGy[23]，故本文所用脱细胞基质作为压疮填充物无微生物、病毒或其他病原体存在，无细胞成分，易于消毒、贮藏。
胰蛋白酶是人体自身也存在的，对人体不致癌、不致畸，γ射线作为组织移植物灭菌，未见其对人体致癌、致畸报道，故本文中基质制备中所使用试剂对人体较安全。HE染色结果发现基质中无细胞、核酸成分，故本文所用脱细胞基质作为压疮填充物抗原性低、不导致免疫及组织相关性疾病。
本实验结果基质内部呈现纤维纵横交错的结构，且微区表面高度与粗糙度和正常皮肤无差异，即基质微观结构未被破坏，有利于细胞长入基质内部[24]。本文基质孔隙率为(86.7±2.1)%，与胡杰等[25]的脱细胞真皮基质材料孔隙率相似(70%～90%)，他们的基质材料在应用时细胞得以长入，又不至于造成纤维消化出现塌陷和空隙层，若本文基质应用于压疮，理应细胞易长入且不易塌陷。
本文表观密度测试发现基质表观密度值为(0.099±0.020)g/cm3，与王一腾[26]的壳聚糖-明胶支架的0.085 g/cm3相似，与徐学盖等[27]的PLA@Gelatin/MNP支架0.073 g/cm3相似。基质压缩弹性模量与正常皮肤相似，用于压疮填充物耐压，抗变形能力强。基质孔隙率、表观密度与对照组相比均具有显著性差异，但弹性模量与对照组相比没有显著差异，说明脱除的细胞成分对基质压缩弹性模量无影响，故本文基质压缩弹性模量与正常皮肤非常相近。
细胞48 h可完全黏附、铺展到基质表面、基质对细胞无毒性作用、基质与细胞体外共培养3 d发现可长入基质内部一部分、共培养9 d可发现细胞充满基质内部，均表明本文的脱细胞基质具有良好的生物学性能。这与人们一直以来认为的组织细胞外基质与其来源的天然组织相似的认识一致，其可能提供重要但未知的，吸引和调节细胞功能的生物信号。这种双重结构-功能关系可以用于再生医学，例如将猪细胞外基质引入伤口，不仅填充了组织空隙，而且通过将负责组织重建的细胞吸引到材料中，随后改变它们的行为来激活增强伤口愈合反应的途径[28]。植入体对生物支架的再生反应，与特定的免疫信号有关，现在认为这是修复和再生过程中的早期关键步骤[29]。
本文使用的是来源于健康人体的同种异体的脱细胞皮肤基质，不会对患者自体其他部位产生损伤，且优于异种基质，作为压疮组织填充物植入人体易于塑形、固定，后期患者细胞长入基质形成新组织，该组织填充物效果可达良久。综上所述，本文所制备的脱细胞基质脱细胞真皮制备方法相对简单，制备条件温和，满足压疮理想填充材料的要求，使用人体脱细胞真皮基质作为组织填充物是治疗压疮可靠的修复手段，值得临床推广。
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