生物酶是一种绿色高效的催化剂，通常具有专一性强、反应条件温和、催化效率高等优点[1]，其催化效率是无机催化剂的107～1 013倍[2]。然而在实际应用中，天然游离酶容易失活，导致其稳定性差、重复利用性低，限制了生物酶的广泛应用。研究表明，固定化技术是解决天然游离酶技术缺陷的有效手段[3-5]。
固定化酶的催化活性在很大程度上取决于固定化的载体材料。近年来纳米纤维如纳米片、层层自组装膜以及三维纳米花、纳米胶束和纳米管等[6-9]已经被用于固定化酶。其中纳米纤维膜因具有比表面积大、负载能力强等优点受到了人们的广泛关注，但是在纳米纤维外表面固定化的酶稳定性较差。TAHERAN et al[10]在聚丙烯腈纳米纤维膜表面固定漆酶，在催化底物2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)反应10次循环后，只保持了其初始活性的17%.ZEUNER et al[11]将乙醇脱氢酶固定在多孔的金属陶瓷基纳米纤维膜的表面，七个循环后该酶的残留活性只有6%.
纳米纤维的制备方法多种多样，其中静电纺丝法制备的纳米纤维膜具有孔隙率高、比表面积大、性能可调控和容易与反应体系分离等优点[12]。常规静电纺丝方法有乳液静电纺、同轴静电纺和多头喷丝等[13-14]。通过同轴静电纺丝法制备的中空纳米纤维[15]，可以将酶包埋在纳米纤维内空腔中，防止生物酶的流失，增强固定化酶的稳定性。目前已经报道的静电纺丝纳米纤维材料包括聚砜、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚丙烯腈、聚四氟乙烯等[16-17]，其中PVDF由于其出色的机械强度、耐化学腐蚀性和良好的热稳定性成为静电纺丝材料的较好选择[18-20]。
为了提高固定化酶的催化活性和稳定性，本研究采用同轴静电纺丝法，制备了中空型PVDF纳米纤维膜，利用内芯纺丝液中添加的多巴胺(dopamine，DA)原位聚合生成聚多巴胺(polydopamine，PDA)，将漆酶(Laccase)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)固定在中空纳米纤维的内空腔中，探讨了外壳纺丝液中PVDF良溶液和不良溶液的溶剂比、纺丝温度、干燥方式等静电纺丝参数对PVDF中空纳米纤维膜形貌及结构的影响，筛选了最优的制备条件，并对在最优条件下制备的PVDF中空纳米纤维膜进行了扫描电子显微镜SEM、比表面积及孔径、亲疏水性等表征，探究了孔分布、亲疏水性对固定化Laccase和HRP的储存稳定性、重复使用性的影响。
1 实验部分
1.1 实验材料
聚偏氟乙烯(PVDF，相对分子质量100万)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，C3H7NO，AR，99.5%)；丙酮(Acetone)；多巴胺盐酸盐；甘油(Glycerol，C3H8O3，≥99%)；异硫氰酸荧光素(FITC)；异硫氰酸罗丹明B荧光素(RBITC)；漆酶(Laccase，来源于云芝，≥0.5 U/mg)；辣根过氧化物酶(HRP，来源于辣根)；2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)；Tris-HCl缓冲液；牛血清蛋白(BSA)；Bradford蛋白试剂盒；高纯水；磷酸盐缓冲液(PBS).
1.2 实验仪器
同轴静电纺丝装置(实验室自装)；扫描电子显微镜(JSM-IT200，日本，测试电压20 kV)；气体吸附分析仪(Autosorb-i3，美国)；接触角测试仪(JC200C，上海梭伦信息科技有限公司)；激光共聚焦测试仪(OLYMPUS，型号：FV1200)；UV-分光光度计(752UV-vis，上海频谱仪器有限公司)。
1.3 中空PVDF纳米纤维膜的制备
采用同轴静电纺丝制备PVDF中空纳米纤维，实验装置如图1所示。配置N，N二甲基甲酰胺(DMF)与丙酮的体积比分别为4∶6、5∶5、6∶4、7∶3的质量分数10%的PVDF聚合物溶液作为外壳纺丝液，甘油作为内芯纺丝液并添加一定量的生物酶和多巴胺(DA).同轴静电纺丝参数为：壳层PVDF溶液进料速率2 mL/h、内芯酶溶液进料速率0.6 mL/h、施加(10±1) kV电压、接收器距喷嘴端15 cm、湿度(35±1)%、静电纺丝温度分别为(20±1) ℃、(25±1) ℃、(30±1) ℃，收集PVDF纳米纤维膜4 h，然后将收集到的纳米纤维膜浸入500 mL超纯水中，溶去内芯的甘油得到PVDF中空型纳米纤维，取出冲洗，在三种不同条件下干燥，-20 ℃保存，观察纳米纤维形貌。
图1 静电纺丝装置图
Fig.1 Coaxial electrospinning device
1.4 生物酶在PVDF纳米纤维中的固定化
将内芯添加DA、Laccase和HRP的PVDF中空纳米纤维膜浸入到0.1 mol/L、pH=7.4的Tris-HCl缓冲液中，DA原位聚合生成PDA固定酶，用Bradford法测定流失到缓冲液中的酶的含量，分析酶在PVDF中空纳米纤维中的固定效果。固定酶后，将纳米纤维膜从缓冲液中取出，室温自然风干，-20 ℃保存。为了证实酶被固定在PVDF中空纳米纤维中，用异硫氰酸荧光素(FITC)和异硫氰酸罗丹明B荧光素(RBITC)分别标记的牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)代替两种酶固定，在激光共聚焦显微镜下观测。
1.5 固定化酶PVDF纳米纤维亲疏水性测试
内芯溶液分别加入0 mg/mL、0.2 mg/mL、2 mg/mL DA，制备固定化酶的PVDF中空纳米纤维。将制备的纳米纤维膜剪成2 cm×2 cm大小的正方形，在接触角测试仪下测量接触角，分析材料亲疏水性。
1.6 固定化酶的活性与酶稳定性测试
以2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)为底物检测固定化Laccase和HRP的活性。将2 cm×2 cm的PVDF中空纳米纤维膜(膜的质量为25 mg，负载酶2 mg)放入反应体系，用UV-分光光度计在420 nm检测1 min内待测量溶液的吸光度变化，计算酶活性，并计算在不同时间间隔时吸光度变化值与时间的比值，表示其酶促反应速率。固定化酶与游离酶的对比实验中，加入游离酶的量和固定化酶的含量相同。测定了两种游离酶和固定化酶在7天内的储存稳定性，以及重复反应10次的重复使用性。
2 结果与讨论
2.1 同轴静电纺丝参数对PVDF纳米纤维膜形貌与结构的影响
2.1.1溶剂比的影响
纺丝液的黏度会影响PVDF中空纳米纤维的形貌。良溶剂DMF和不良溶剂丙酮的比例不同，PVDF聚合物纺丝液的黏度也不同，因此制备了DMF与丙酮体积比分别为4∶6、5∶5、6∶4、7∶3的PVDF纳米纤维膜，形貌如图3所示。当DMF与丙酮体积比为4∶6时(图2(a))，纤维呈现带状，有部分粘连和破损；当DMF与丙酮体积比为5∶5时(图2(b))，纤维之间相互粘连；当溶剂比为6∶4时(图2(c))，纤维直径分布不均匀；当溶剂比为7∶3时(图2(d))，单根纤维几乎没有粘连，且直径分布均匀。这是由于当DMF与丙酮体积比为7∶3时，外壳纺丝液的黏度和同轴静电纺丝的参数相匹配，电场力能够克服表面张力，形成Taylor锥实现稳定喷射流，随之高分子射流拉伸形成丝状聚合物纤维，溶剂在拉丝伸长的过程中不断挥发，最后沉积到滚筒接收器上形成具有规整形貌的PVDF纳米纤维膜。
DMF与丙酮的体积比分别为(a)4∶6、(b)5∶5、(c)6∶4、(d)7∶3
图2 DMF与丙酮不同体积比时PVDF纳米纤维膜载体的SEM图
Fig.2 SEM images of PVDF nanofiber membrane carrier with different volume ratio of DMF to acetone
2.1.2温度的影响
温度影响溶剂丙酮的挥发从而影响纺丝液的黏度，因此探究了温度对PVDF中空纳米纤维形貌的影响。在温度分别为(20±1) ℃、(25±1) ℃和(30±1) ℃时制备了PVDF中空纳米纤维膜，形貌如图3所示，当温度为(20±1) ℃、(25±1) ℃时，单根纤维几乎粘连成块(图3(a)和图3(b)).粘连的主要原因是温度过低，纺丝过程中溶剂不能及时挥发，纤维沉积导致单根纤维中的溶剂互溶。这种粘连成块的纤维结构会影响底物与酶的接触，降低固定化酶的活性。当温度为(30±1) ℃时溶剂在纺丝过程中及时挥发，呈现出均匀规整的PVDF纳米纤维形貌(图3(c)).
DMF与丙酮的体积比为7∶3，(a) (20±1) ℃，(b) (25±1) ℃，(c) (30±1) ℃
图3 不同温度下PVDF纳米纤维膜载体的SEM图
Fig.3 SEM images of PVDF nanofiber membrane carrier at different electrospinning temperatures
2.1.3干燥方式的影响
考虑到酶对温度的耐受性，我们对载体的干燥方式做了探究。用上述优化的电纺参数制备PVDF纳米纤维膜，浸入水中溶去内芯的甘油，然后采用40 ℃真空干燥、室温下自然风干、冷冻干燥3种不同方式干燥，PVDF纳米纤维膜的截面结构如图4所示。采用真空干燥(图4(a))，PVDF纳米纤维膜中空结构变瘪，破裂；采用冷冻干燥(图4(c))，PVDF纳米纤维膜截面拉伸撕裂，并且分层；将PVDF纤维膜放在通风柜中，室温下自然风干，干燥之后中空结构完整(图4(b)).因此，自然风干能维持PVDF纳米纤维的中空结构。
图4 不同干燥方式下PVDF纳米纤维膜载体横截面的SEM图
Fig.4 SEM images of the cross section of PVDF nanofiber membrane carrier with different drying conditions
2.1.4PVDF纳米纤维膜的孔结构
经静电纺丝参数的优化，在溶剂比7∶3、温度为(30±1) ℃时电纺，自然干燥，可制备出直径均匀的PVDF中空纳米纤维膜。纳米纤维的孔道结构是酶与底物的接触通道[21]，因此进一步对PVDF中空纳米纤维的孔结构进行探究。PVDF中空纳米纤维膜载体表面形貌如图5所示。单根纤维表面有大量孔隙。孔的形成是由于外加电压使得聚合物液滴带电，溶液中电荷转移，在喷丝时造成了PVDF聚合物与溶液的相分离，且DMF与丙酮混合溶剂的沸点降低，溶剂挥发在纤维表面形成了大小随机的孔隙。为了进一步研究PVDF中空纳米纤维表面的孔结构，对PVDF中空纳米纤维膜做了氮气吸脱附实验，结果如图6所示，PVDF中空纳米纤维膜的比表面积为20.557 m2/g，孔径分布在3～5 nm、20～40 nm左右，大于底物的尺寸，为底物与酶的接触提供了物理通道。
图5 PVDF中空纳米纤维膜载体表面形貌
Fig.5 SEM image of the surface morphology of PVDF
nanofiber membrane carrier
图6 PVDF纳米纤维膜的氮气吸脱附曲线(a)和孔径分布图(b)
Fig.6 (a)Nitrogen adsorption-desorption curves and (b) pore size
distribution of PVDF nanofiber membrane
2.2 生物酶在PVDF中空纳米纤维内空腔中的固定化
Laccase与HRP具有催化活性，可以与荧光分子发生反应而无法进行标记。Laccase与HRP的本质是蛋白质[22-23]，因此，为了确认Laccase和HRP这两种生物酶可以固定在PVDF中空纳米纤维中，在最佳同轴静电纺丝参数条件下，将具有绿色荧光FITC标记的BSA和红色荧光RBITC标记的BSA代替Laccase和HRP加入内芯纺丝液，制备荧光标记的PVDF中空纳米纤维。将带有FITC和RBITC标记BSA的PVDF中空纳米纤维膜浸在0.1 mol/L、pH=7.4的Tris-HCl缓冲液中4 h固定荧光标记蛋白，在激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察固定化BSA后的PVDF中空纳米纤维膜，结果如图7所示。固定有两种荧光标记蛋白的纳米纤维在488 nm处发出绿色荧光(图7(a))，在559 nm处发出红色荧光(图7(b))，绿色荧光和红色荧光照片叠加，显示出黄色(图7(c))，与明场照片中纳米纤维一一对应(图7(d))，表明2种荧光标记的BSA是在纳米纤维内部均匀分布的。内芯添加的DA原位聚合生成PDA[24]可以将生物酶均匀地固定在PVDF中空纳米纤维的内空腔中。采用Bradford法测定酶流失的量，计算得到81.3%的Laccase和HRP被固定在PVDF中空纳米纤维中。
图7 固定化FITC-BSA和RBITC-BSA的PVDF纳米纤维膜的激光共聚焦图
Fig.7 CLSM images of PVDF nanofiber membrane with FITC-BSA and RBITC-BSA
2.3 固定化酶的PVDF中空纳米纤维膜的亲疏水性
在酶固定化的过程中，DA聚合生成的PDA与PVDF中空纳米纤维复合时，会改变PVDF中空纳米纤维膜载体本身的亲疏水性[25]。因此我们制备了内芯纺丝液中DA质量浓度分别为0 mg/mL、0.2 mg/mL、2 mg/mL的PVDF纤维膜，接触角测试如图8所示。当内芯纺丝液中不添加DA时(图8(a))，纤维膜载体的接触角为104.4°，其疏水性强归因于PVDF材料表面的F元素[26]。加入DA后，接触角逐渐降低显示出亲水性，这是由于生成的PDA中含有—OH和—NH3亲水性基团导致的。PDA改善了PVDF载体的强疏水性，有利于载体固定化生物酶后参与水环境中的催化反应。
2.4 PVDF中空纳米纤维膜固定化酶的催化活性与存储稳定性
通过检测Laccase/HRP-PDA@PVDF的催化活性，发现固定化之后2种酶Laccase/HRP的酶催化活性保持了游离酶的80%，比文献中报道的固定化酶的活性(50%)高[27]。这归因于PVDF中空纳米纤维载体表面的孔结构为Laccase/HRP与底物的接触提供了有效的物理通道，此外PDA在中空纳米纤维内部形成了一层亲水层，对酶的亲和力使得固定化酶稳定性提高[28]。
Laccase/HRP-PDA@PVDF与相同含量的游离酶在4 ℃磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)中的存储稳定性如图9所示。图9(a)是固定化酶和游离酶与ABTS反应产生的紫外吸收强度随储存时间的变化曲线，图9(b)是固定化酶和游离酶的相对活性随储存时间的变化。图9(a)表明游离酶的最初活性高于固定化酶，但是游离酶活性急剧下降，固定化酶的活性衰减缓慢，在第一天出现交叉点，从第二天开始固定化酶的活性高于游离酶。储存7 d后游离的Laccase/HRP的酶活性降低了60%，而Laccase/HRP-PDA@PVDF的活性只降低了18%，固定化酶仍保持初始活性的82%.这归因于Laccase/HRP固定在PVDF中空纳米纤维的内空腔中，外层的聚合物对纤维内部的生物酶起保护作用，避免外部环境对酶活性的影响；而且内空腔中用来固定酶的PDA让纳米纤维膜载体更加亲水，对酶有亲和作用，所以固定化酶的存储稳定性高于游离酶。
内芯纺丝液中DA的质量浓度为：(a) 0 mg/mL、(b) 0.2 mg/mL、(c) 2 mg/mL
图8 PVDF纳米纤维膜载体的接触角示意图
Fig.8 Contact angle images of PVDF nanofiber membrane
图9 游离酶和固定化酶在4 ℃磷酸盐缓冲液
(pH=7.4)中的存储稳定性
Fig.9 Storage stability of free and immobilized enzymes
in 4 ℃ phosphate buffer (pH=7.4)
2.5 固定化酶的重复使用性
重复使用性是酶固定化的重要性能之一，因此我们检测了固定化Laccase/HRP的PVDF中空纳米纤维膜重复反应10次的催化活性，如图10所示。从图中可以看出，进行10个反应操作后，固定化酶仍保持初始活性的40%以上，比文献[10-11]报道的重复使用性好。这是由于除了外层PVDF聚合物的保护作用，内部原位生成的PDA将Laccase/HRP固定在纳米纤维的内空腔中，降低了酶的流失。
图10 Laccase/HRP-PDA@PVDF催化底物ABTS的重复使用性
Fig.10 Laccase/HRP-PDA@PVDF reusability test
by catalyzing substrate ABTS
2.6 固定化酶的反应速率
酶被固定在PVDF中空纳米纤维的内部活性较高、稳定性良好，但聚合物壳层会影响底物与内空腔中固定化酶的接触，进而对固定化酶的反应速率产生影响。为此，以ABTS作反应底物，计算了游离Laccase/HRP和固定化酶Laccase/HRP-PDA@PVDF分别在1～5 min、5～10 min、10～20 min区间内紫外吸光度与时间的比值ΔA/ΔT，以此表示反应速率，结果如图11所示。实验显示在反应最开始固定化酶的速率低于游离酶，这是由于聚合物管壁对底物扩散进入中空纳米纤维的阻碍造成的；而在10 min后固定化酶的速率比游离酶高，可能是由于Laccase/HRP两种酶在中空纳米纤维内部形成了底物通道提高了催化活性；在20 min时，固定化酶的反应速率与游离酶相当，说明这时反应都趋近了平衡。
图11 游离Laccase/HRP和Laccase/HRP-PDA@PVDF分别在
1～5 min、5～10 min、10～20 min区间内的反应速率
Fig.11 Reaction rate of free Laccase/HRP and Laccase/HRP-
PDA@PVDF in the interval of 1～5 min, 5～10 min,
and 10～20 min
3 结论
1) 探究了同轴静电纺丝参数如溶剂比、温度、干燥方式等对PVDF中空纳米纤维膜载体形貌的影响，最佳纺丝条件为DMF和丙酮的溶剂比7∶3、温度为(30±1) ℃、自然干燥。
2) 在最佳纺丝条件下制备PVDF中空纳米纤维，在其内空腔中原位生成PDA并固定化2种酶Laccase和HPR，测试了固定化酶的亲疏水性、催化活性、存储稳定性和重复使用性。与游离酶相比，固定化Laccase/HRP的稳定性大大提高，在4 ℃磷酸盐缓冲液中存储7 d仍保持其初始活性的82%，固定化酶在进行10个反应操作后仍保持其初始活性的40%以上，研究结果表明同轴静电纺丝法制备的表面多孔的PVDF中空纳米纤维膜是酶固定化的优良载体。
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