细胞在黏附、铺展和迁移过程中通过肌动蛋白和肌球蛋白等细胞骨架体系产生牵引力，在炎症、伤口愈合、血管再生和肿瘤转移等诸多生物学过程中发挥重要作用[1-2]。在二维平面培养体系中，可根据细胞在迁移或铺展过程中硅胶膜基底产生的褶皱，或未起皱硅胶膜弹性膜上包被的微米级乳胶小球的位置变化，大致估算细胞所产生的牵引力的大小，但褶皱变形和小球的位移与细胞牵引力之间的关系为非线性，不能采用经典的弹性理论进行分析[3-6]。细胞在软的凝胶或高分子聚合物弹性基底表面局部黏附产生的牵引力，可采用线弹性连续介质理论进行分析，但细胞产生牵引力的同时会在一定范围内引起基底发生形变，无法真正获得局部某个黏附点的牵引力[7]。
鉴于原位生长在组织的细胞，通过黏附与周围具有三维空间的细胞外基质之间发生相互作用，发展可直接测量并分析三维空间的细胞牵引力方法，将进一步拓展对细胞-细胞以及细胞-微环境之间相互作用等的理解。有学者探索了在细胞上下表面均铺有包埋荧光粒子的软凝胶，结合显微成像技术[8]、在微柱上包被纤连蛋白，通过弹性微柱的形变[9]可检测细胞在2.5维空间微环境中所产生的牵引力。但真正实现细胞在三维微环境中牵引力的测量仍是一个挑战。
为解决上述困难，本文将设计并加工一种Parylene-C微板用于细胞的培养与细胞在三维微环境中牵引力的测量研究。 Parylene-C是一种具有保型性淀积特性、化学惰性以及透光性的聚合物[10]，因其具有良好的生物兼容性而开始越来越多地应用于生物研究领域[11]，如作为生物电极的包裹层[12-13]、液体药物的存储容器[14-15]以及视网膜移植手术中的辅助材料[16-18]等。2012年日本东京大学研究人员利用细胞牵引力将Parylene-C薄膜折成了很好的立体三维结构，细胞可通过牵张力使薄膜折叠，制备出各种不同形状的空管结构，主要应用于诸如具有管状结构的人工血管支架和细胞三维生长环境的构建[19]。该研究为实现三维细胞牵张力的测量提供了很好的启示，但要应用于单细胞牵张力的测试，在微板的结构和加工工艺上仍需要进一步改进。
本文所设计的Parylene-C微板将采用MEMS微加工方法，通过Parylene-C薄膜的淀积与刻蚀进行制备。本文的Parylene-C微板涉及两个厚度的Parylene-C组成部分：一对3 μm厚的方形主体部分以及它们之间100 nm厚的连接部分。该连接通常可以通过对3 μm厚的Parylene-C主体部分之间剩余Parylene-C进行第二次刻蚀得到，但由于受限于Parylene-C刻蚀工艺的刻蚀精度与刻蚀均匀性，很难精确控制第二次刻蚀的厚度。本文通过合理的方案设计和技术路线，在第一次刻蚀时将方形区域之间的3 μm厚Parylene-C完全刻蚀掉，然后再淀积一层100 nm厚Parylene-C薄膜并刻蚀出方形区域之间的连接。由于Parylene-C淀积对厚度控制精确度更高，因此可通过该方法精确得到厚度为100 nm的连接区域。通过该方法，本文制备了一种可用于测量单细胞牵张力的Parylene-C微板。
1 微板设计
为实现单细胞空间折叠，微板结构设计如图1所示。硬度较大的玻璃作为底层，便于微折叠板向培养皿中转移。中间牺牲层Gelatin(明胶)在37 ℃水中能够溶解，从而释放上层Parylene-C微板。上层Parylene-C微板两侧是厚度和边长分别为3 μm和50 μm的方形Parylene-C区域。Parylene-C微板中间连接处的厚度为100 nm，宽度为5 μm，为两侧板折叠起到柔性连接的作用。
图1 微板结构示意图
Fig.1 Schematic of microplate structure
2 实验过程
2.1 微板加工
首先通过第一次刻蚀得到左右两个间距为5 μm、 厚度为3 μm的方形Parylene-C区域；然后，再淀积一层100 nm厚的Parylene-C，并通过刻蚀所设计微板图形之外的该层Parylene-C，完成方形区域之间的连接，刻蚀示意图如图2所示。
图2 优化后Parylene-C微板两次刻蚀示意图
Fig.2 Schematic of the two-step etching of Parylene-C
microplate after optimization
优化后的工艺流程如图3所示。本文使用厚度为450 μm的4英寸玻璃片(型号：BF33)作为微加工基底。采用2 000 r/min转速在玻片表面旋涂Gelatin，旋涂后需要在95 ℃真空烘箱中加热40 s.旋涂后，使用真空气相淀积系统(型号：SCS PDS2010)沉积淀积3 μm厚Parylene-C.第一次旋涂光刻胶使用正性光刻胶(型号：RZJ-304-50)，旋涂采用转速为2 000 r/min，时间为30 s.旋涂后，需要在95 ℃真空烘箱中加热40 s.本实验使用光刻机(型号：SUSS MA-6)对光刻胶进行曝光处理以得到所需图形，曝光时间为60 s.曝光后进行显影(显影液型号：RZX-3038)，显影时间为80 s.本实验使用等离子体刻蚀机(型号：ME-6A)刻蚀Parylene-C.刻蚀所用气体O2，流量为60 mL/min；射频功率为250 W，刻蚀时间为600 s.刻蚀结束后，使用丙酮浸泡5 min，去除Parylene-C表面残留的光刻胶。使用真空气相淀积系统(型号：SCS PDS2010)第二次沉积Parylene-C.为得到100 nm厚的Parylene-C薄膜，需要加入0.16 g原料。第二次旋涂光刻胶使用正性光刻胶(型号：RZJ-304-25)，旋涂采用转速为3 000 r/min，时间为60 s.旋涂后需要在95 ℃真空烘箱中加热30 s.本实验使用光刻机(型号：SUSS MA-6)对光刻胶进行曝光处理以得到所需图形，曝光时间为7 s.曝光后进行显影(显影液型号：RZX-3038)，显影时间为45 s.本实验使用等离子体刻蚀机(型号：ME-6A)刻蚀Parylene-C.刻蚀所用气体为O2，流量为60 mL/min；射频功率为250 W，刻蚀时间为60 s.刻蚀结束后，使用丙酮浸泡5 min，去除Parylene-C表面残留的光刻胶，然后用无水乙醇与去离子水清洗，氮气吹干，得到目标形状和尺寸的Parylene-C微板。
图3 微板加工流程图
Fig.3 Fabrication process of microplate
2.2 细胞实验
在微折叠板上接种细胞之前，先通过光刻胶的剥离工艺在玻璃片上非Parylene-C区域进行MPC聚合物修饰，以阻止细胞在Parylene-C区域之外发生黏附。在光刻胶剥离之后，对微板表面修饰Ⅰ型胶原，以增强其与目标细胞的黏附。成纤维细胞培养采用DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清、10 mg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)。将细胞接种于Parylene-C微板上，控制细胞浓度，使得每对微板上只生长一个细胞。37 ℃、体积分数为5% CO2条件下培养4 h后换液，培养24 h后进行细胞折叠实验。
3 结果与讨论
3.1 微板加工结果与讨论
采用MEMS微加工方法制备的Parylene-C微板如图4所示，其中图4(a)是加工后的整体玻璃片，其表面制备有Parylene-C微板阵列；图4(b)是显微镜明场下的微板阵列。
图4 微板阵列
Fig.4 Photo of microplate array
微板中Parylene-C的厚度通过测量与玻璃片一起淀积的硅片上的Parylene-C厚度得到。测量使用设备为膜厚仪(型号：K-MAC ST2000)，设计厚度为3 μm的Parylene-C膜实际测量厚度为(3.32±0.05)μm，设计厚度为100 nm的Parylene-C膜实际测量厚度为(124.3±4.6) nm.
通过该测量结果可知，第二次Parylene-C淀积时，Parylene-C的厚度可以控制在100 nm左右，而第二次刻蚀并未对方形区域之间的Parylene-C进行刻蚀，因此保证了微板设计中3 μm厚方形Parylene-C区域之间100 nm厚Parylene-C柔性连接的实现。
微板中图形尺寸由扫描电镜(型号：HITACHI UHR FE-SEM SU8200)拍照并测量得到。测量结果如图5所示。方形Parylene-C实际测量边长为(50.9±0.8)μm(设计尺寸为50 μm)，方形Parylene-C对之间实际测量间隔为4.64 μm(设计尺寸为5 μm).
图5 微板扫描电镜图片
Fig.5 SEM image of microplate
长度的尺寸误差是由光刻的曝光与显影以及Parylene-C刻蚀引入的，成品可以满足实验需求。另外，从图5中可以看出，方形区域之间100 nm厚的Parylene-C柔性连接并未完全与第一次刻蚀后的Parylene-C方形区域之间的凹槽吻合，存在左右偏差，这是由于第二次光刻时与第一次光刻图形存在2 μm的系统对准精度所致。
3.2 细胞实验结果与讨论
成纤维细胞接种于Parylene-C微板上后，37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养24 h，细胞铺展状态良好，经显微操纵器触发微板后，能成功引起微板折叠，如图6所示。
图6 细胞牵引力折叠微板
Fig.6 CTFs fold microplate
细胞接种于微板上，能否实现细胞只生长在微板区且每个微板上只有一个细胞生长的效果，主要取决于两个方面的因素。一是MPC聚合物涂层的修饰是否成功，MPC聚合物的修饰若不均匀或根本未嫁接到非微板区，会导致整个玻片基底上不止微板区有细胞生长，非微板区也会铺满细胞；或者即便是单个细胞落在微板区，在完成铺展后，细胞会因为微板外空间没有MPC聚合物阻止黏附的作用而生长至微板外，也就是铺展到非微板区，这样一个细胞就会横跨微板区和非微板区。二是细胞悬液浓度的调整，不同的细胞类型，因铺展后的面积和增殖速度不同，需要摸索不同的接种浓度以达到最佳单细胞生长效果。本实验中成纤维细胞的细胞悬液浓度经不断调试后确定为4×104mL-1，每个35 mm培养皿中接种1 mL细胞悬液，能很好地实现整个基底上的单细胞-微板培养。微板阵列被单细胞覆盖的比率可达75%～80%左右，能为后续单细胞牵引力的测量实验提供很好的基础条件。
4 结论
本研究采用MEMS微加工工艺，加工方案经优化设计，通过两次Parylene-C淀积与刻蚀，最终制备出具有(124.3±4.6) nm柔性连接的Parylene-C微折叠板，从而能很好地实现细胞黏附所引起的微板折叠，有效地避免了微板连接处硬度太高所引起的折叠失败和后续计算牵张力的误差。
细胞铺展和黏附面积很大程度上取决于细胞可黏附区域的大小。本文微板制备工艺可精准控制微板方形区域Parylene-C的厚度和面积，后续的研究将进一步考虑微板面积与细胞黏附面积的关系。微板形状设计的不同可能也会引起细胞铺展形态发生改变，进而也会影响细胞与微板的黏附模式。后续尝试设计多种微板形状用于对细胞牵张力的测试也是非常必要的。此外，100 nm厚度的Parylene-C微折叠板连接虽然能很好实现细胞对微板的折叠，但建立细胞牵张力与微板折叠角度的定量关系是至关重要的，比如细胞使微板发生折叠后，根据微板的折叠角度，再结合有限元模拟微板折叠相应角度所需的弯矩，即可计算出单细胞牵引力的大小。这将是本文后续研究的重点。
本文细胞实验证实，Parylene-C微板可用于计算和分析不同类型黏附细胞的牵引张力，为细胞力学生物学领域研究细胞-基质黏附、细胞铺展、细胞分裂以及细胞力学特性提供了一种有效的测量方法。
[1] SCHWARZ U S,GARDEL M L.Uinited we understand:intergrating the actin cytoskeleton and cell-matrix adhesions in celluar mechanotransduction[J].Journal of Cell Science,2012,125(13):3051-3060.
[2] WANG J H,LIN J S.Cell traction force and measurement methods[J].Biomechanics & Modeling in Mechanobiology,2007,6(6):361-371.
[3] FRIEDL P,BROCKER E B.The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix[J].Cellular and Molecular Life Sciences,2000,57(1):41-64.
[4] HARRIS A K,WILD P,STOPAK D.Silicone rubber substrata:a new wrinkle in the study of cell locomotion[J].Science,1980,208(4440):177-179.
[5] 王丽丽，陈维毅. 细胞不同铺展程度的张拉整体模型的计算分析[J].太原理工大学学报，2019,50(3)：380-385.
WANG L L,CHEN W Y.Calculation analysis of tensegrity with different spreading degree of cells[J].Journal of Taiyuan University of Technology，2019,50(3)：380-385.
[6] 王丽丽，陈维毅.可折叠微板上的细胞牵张力的计算[J].太原理工大学学报，2019,50(1)：130-134.
WANG L L,CHEN W Y.Traction force calculation of cell on foldable alicroplate[J].Journal of Taiyuan University of Technology，2019,50(1)：130-134.
[7] WANG J,LI B.Cytoskeleton methods and protocols-methods in molecular biology series[M].New York:The Humana Press,2009.
[8] BENINGO K A,DEMBO M,WANG Y L.Responses of fibroblasts to anchorage of dorsal extracellular matrix receptors[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2004,101(52):18024-18029.
[9] GHIBAUDO M,DI M J M,HERSEN P,et al.Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned enviroments[J].Lab on a Chip,2011,11(5):805-812.
[10] HAGGREN Y,SHAH A,AUTERE A,et al.Nanowire encapsulation with polymer for electrical isolation and enhanced optical properties[J].Nano Research,2018,10(8):2657-2666.
[11] KIM B J,MENG E.Micromachining of parylene C for bio-MEMS[J].Polymers Advanced Technologies,2016,27:564-576.
[12] KUO J T W,KIM B J,HARA S A,et al.Novel flexible parylene neural probe with 3D sheath structure for enhancing tissue integration[J].Lab on a Chip,2013,13:554-561.
[13] XIE X,RIETH L,WILLIAMS S,et al.Long-term reliability of Al2O3and parylene C bilayer encapsulated utah electrode array based neural interfaces for chronic implantation[J].Journal of Neural Engineering,2014,11(2):026016.
[14] BINH-KHIEM N,MATSUMOTO K,SHIMOYAMA I.Porous parylene and effects of liquid on parylene films deposited on liquid[C]∥IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems,Cancun,Mexico,2011:111-114.
[15] CHARMET J,BANAKH E,LAUX B,et al.Liquid as template for next generation micro devices[J].Journal of Physics:Conference Series,2009,182:012021.
[16] BRANT F R A,STEFANINI F R,FALABELLA P,et al.Development of a new tissue injector for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigmented epithelium[J].International Journal of Retina and Vitreous,2017,3(1):41.
[17] LU B,ZHU D,HINTON D,et al.Mesh-supported submicron Parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells [J].Biomedical Microdevices,2012,14(4):659-667.
[18] HU Y,LIU L,LU B,et al.A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer[J].Ophthalmic Research,2012,48(4):168-191.
[19] KURIBAYASHI-SHIGETOMI K,ONOE H,TAKEUCHI S.Cell origami:self-folding of 3D cell-laden microstructures driven by cell traction force[J].PloS One,2012,7(12):e51085.
