在生物细胞工程、药物研究及环境监测等领域，常需要对流体内微粒进行分析研究，因此在流体中实现对微粒的操控具有重要研究意义和实用价值[1-2]。与各类操纵技术，如流体聚焦[3]、光镊[4-5]和磁场分离[6]等相比，介电泳技术[7-8]基于电场力产生的稳定捕获场，可以实现微米级生物粒子[9-11](诸如蛋白质、核酸、脂质和糖类等生物大分子及细胞)的分离、捕获和定向操纵，具有精确、快速、低成本、无标记的优点[12-13]。
1951年介电泳现象由美国物理化学家POHL[14]首次在实验中发现，悬浮在介质中的微粒在非均匀电场作用下可产生定向运动，其运动方向取决于二者介电常数的相对大小。到20世纪90年代，随着微纳加工技术的出现，利用介电泳效应收集、定位和分离悬浮液中的微粒的技术取得了很大的进步，临床医学和药理学研究的迫切需求也促进了介电泳技术的发展[15]。介电泳技术依赖于粒子和介质溶液的固有电性质，被操控的目标粒子不需要标记，同时介电泳芯片的实现方式相对简单，因此成为微流控设备中实现大量粒子(如细胞、蛋白质、DNA和病毒等)集体性操控法的最广泛的方法之一[7,15]。
DASTIDE R et al[16]设计并制备了一种基于叉指电极阵列的阻抗生物传感器，利用正介电泳力将大肠杆菌聚焦并集中到微通道的中心，并将其引导检测区微通道，实现了低浓度大肠杆菌O157:H7的检测。KIM et al[17]人在微流控芯片中，设计了六电极芯片产生介电泳力，促进胶体微球的晶体生长，从而形成尺寸约为200 μm的非离子聚丙烯酰胺(PAA)晶体团簇。COTTET et al团队[18]设计了由8个电极组成的圆形排列介电泳芯片，并验证了其捕获性能，采用PS微球和HEK细胞进行了实验测试，在流动状态中实现了可控制大小和成分的细胞聚集体。虽然以上结构都实现了对溶液内目标微粒不同形式的汇聚，但是所用电极结构较为复杂，需要高精度光刻工艺才能实现，提高了器件的经济和时间成本。
本文设计并制备了基于星形平面电极的聚苯乙烯(PS)微球富集芯片，充分利用星形结构产生的不均匀电场，在介电泳力作用下形成了微球聚集体。采用lift-off工艺，克服了阵列电极加工工艺复杂的问题，制作成本低廉。研究了信号频率、幅值大小、PS微球浓度对汇聚效果的影响，该电极芯片利用比较简单的结构就完成了对大量微球的定向集体性运动控制，实现了良好的富集效果，对后续实现对微米级生物粒子的操纵，研究其生理、病理性质奠定了基础。
1 实验原理与装置
1.1 介电泳原理
本文设计的星形平面电极结构如图1所示。在非均匀电场中，悬浮在磷酸缓冲盐溶液(PBS)内PS微球在介电泳力作用下向星形电极的中心移动，达到富集的效果。其在电场中所受到的介电泳力可用式[13,19]表示
(1)
式中：R是粒子半径；
为星形电极上所加电场的平方梯度(E表示所加电场的电场强度)；εm为介质溶液的介电常数；克劳修斯-莫索缔(CM)因子由下式给出
(2)
式中：ε是介电常数，下标p和m分别代表粒子和介质溶液。CM因子的正负决定粒子受到正介电泳响应或者负介电泳响应，这意味着粒子向高电场或低电场的区域移动。CM因子的实部定义为
(3)
式中：εp为PS微球的介电常数；
分别为粒子和介质的复介电常数，且
为缓冲液的电导率；ω为所施加电场的角频率[14，20]。
图1 介电泳力操纵PS小球富集示意图
Fig.1 Illustration of PS pellet enrichment manipulated by dielectrophoretic force
在悬浮液内，PS微球处于非匀强电场内，其感应电荷的分布不对称[15,19]。因极化作用与介质接触的表面诱导出电荷形成电偶极子，其电性会随着电场的变化发生反转使得微球发生定向的迁移运动。如图1所示，两个相对电极接入相同极性的信号，使得相邻两个电极的极性相反，星形电极外接交流信号会产生非均匀电场，在电极的边缘处存在着强电场，而远离边缘的电极中心为弱电场区。
当PS微球比介质溶液有着更差的极化性质，微球表面的电偶极子会排斥电场，向着电极边缘汇聚。从空间角度看，电场便会绕过微球使其向强电场方向移动，如图2中a粒子，也就是说小球受到了正介电泳力[20-21]。当介质溶液极化量大于微球极化量，微球表面吸引较多的异性电荷，电场便会穿过微球内部使其向弱电场方向移动，即电极边缘处的PS微球向着星形电极的中心运动，也就是说粒子受到了负介电泳力作用[21]，如图2中b粒子所示。在微粒与介质溶液确定的情况下，介电泳力的正负取决于Re[fcm]的符号，大小由施加电场决定，因此可以通过调节频率和电场强度，提高PS微球的富集效率。
图2 非均匀场中介质粒子极化示意图
Fig.2 Schematic diagram of dielectric particle polarization
in inhomogeneous field
1.2 实验装置
实验试剂为AZ5124光刻胶、AZ系列显影液、丙酮和无水乙醇。采用PS微球(单分散PS微球直径为5 μm，密度为1.030 kg/m3，购于天津倍思乐色谱技术开发中心)与去离子水配制不同比例浓度的PS微球悬浮液。采用少量磷酸盐缓冲液制备低电导率溶液，使用移动式电导率仪(希玛AR8011)测量其电导率，用此溶液调节PS悬浮液的电导率。PS微球悬浮液现用现配，并用超声清洗机震荡10 min使PS微球均匀分散。
星形电极各部分尺寸如图3(a)所示，以15 mm×15 mm普通白玻璃为基底，采用金属剥离(Lift-off)工艺在基底上形成星形电极。其中PS小球富集区域的最大间隔为450 μm，相邻两个电极的最小间隔为200 μm.电极的制作工艺流程如图3(b)所示，实验前将玻璃基底依次置于去离子水、无水乙醇和异丙醇内，之后用超声清洗机各清洗15 min，保证基底的整洁性为下一步实验做准备。选用正/负可改变型光刻胶AZ5214的正胶性质，使用匀胶机将其均匀涂覆在玻璃基底上，前烘坚膜后在紫外灯下(沃科技有限公司生产，其型号为FUV-6BK)曝光，经过AZ显影液去除溶解曝光过的光刻胶。采用磁控溅射镀膜技术(中国科学院沈阳科学仪器股份有限公司，JGP-450磁控溅射系统)在基底上镀5 nm的Cr和100 nm的Au.之后将玻璃基底置于丙酮或酒精中，附在残留光刻胶上的Au膜会被剥离，最终得到星形结构的电极。Cr的作用是增强Au膜与衬底的粘附性，避免在剥离过程中Au膜在丙酮或酒精溶液内脱落。
图3 星形电极结构
Fig.3 Star electrode structure
2 结果与分析
本文以5 μm PS微球为研究对象，实验定性分析了溶液电导率、交流信号电场频率和幅值以及汇聚时间对PS微球富集的影响，以PS微球的团簇状态验证星形电极的富集效果。
根据介电泳力公式(1)和CM因子定义公式(3)可知，影响微粒受力的参数有：介质溶液的介电常数εm、粒子半径R、CM因子(粒子介电常数εp，电导率σ和电场的角频率ω)和电场强度E.选用PS微球为实验分析物，因此R和εp两个参数为确定值。介质溶液的介电常数εm由其电导率σ和电场频率ω共同决定，电场强度E由信号电压决定，因此调节电导率，信号电压及电场频率可以改变微粒所受到的介电泳力，从而获得理想的富集效果。
2.1 临界频率的测定
根据公式(3)可知，电导率和信号频率影响粒子和介质的复介电常数，CM因子的实部由粒子和介质的复介电常数决定，并且CM因子的正负决定粒子受正介电泳响应或者负介电泳响应。因此当所研究的微粒已确定，则其电导率为常数，施加在颗粒上的介电电泳响应取决于介质溶液的电导率和信号频率。理论研究表明[22]，当溶液介质为低电导率时，可获得较好的负介电泳效应。因此，本文首先使用低电导率的介质溶液，研究改变信号频率对微球所受介电泳力方向的影响，为PS微球的富集提供依据。
使用移液枪向芯片上注入100 μL PS微球悬浮液，施加电压峰值VP-P为5 V的交流信号，改变施加信号的频率，观察PS微球的介电泳响应。未施加交流电压时，PS微球均匀的分散在电极上，如图4(a)所示；当信号频率为1 kHz时，PS聚苯乙烯微球受到负介电泳力向电场强度弱的区域运动，电极边缘处的PS微球向星形区域中心富集，如图4(b)所示；当频率为1 MHz时，PS聚苯乙烯微球同样受到负介电泳力向电极中心富集，如图4(c)所示。
图4 PS微球的介电泳响应
Fig.4 Electrophoretic response of PS microspheres
结果表明，在电导率较低的悬浮介质中，PS微球在频率1 kHz到10 MHz均表现出负介电泳行为，其中在1 MHz时，PS微球呈现向中心团簇效果最佳，即负介电泳力效果最好。同时，在此实验中观察到溶液电导率主要影响PS微球所受的介电泳力方向，而对其大小无显著的影响。
2.2 交流信号电压幅值对于汇聚效果的影响
由微粒所受介电泳力公式(1)可知，交流信号电压的幅值直接决定了其所受介电泳力的大小。根据以上对频率研究的基础上，考察电压幅值对PS微球富集的影响，对电极芯片上的低电导率PS悬浮液施加频率为1 MHz的交流信号，记录了幅值VP-P为3 V、9 V和14 V下PS微球的运动情况。
如图5(a)所示当正弦信号电压VP-P为3 V时，PS微球受到负介电泳力向电极中心缓慢运动，最终到达中心成为团簇状态耗时达1 h以上；将正弦信号电压幅值VP-P调整为9 V时，在CCD相机系统下观察到当电极接入信号瞬间，PS微球受到负介电泳力迅速向电极中心聚拢，由于相邻的两个电极间隙尺寸小，如图5(b)所示该区域附近的PS微球优先在这里成点线状团簇，而相对的两个电极边缘附近的PS微球要经过15 min才能到达中心成富集状态；当调整电压幅值VP-P为14 V时如图6(c)所示，PS微球同样向电极中心运动，但是速度比较慢，最终成团簇状态需要45 min.
图5 不同交流信号电压幅值下的富集效果
Fig.5 Enrichment effect under different amplitude of AC signal voltage
如图6所示，通过实验研究了1～16 V电压值VP-P下PS微球呈现富集状态所需要的时间。从图中可以看出电压幅值过大或者过小，PS微球在介质溶液内富集所需要的时间都比较久，而在电压值VP-P为9 V附近用时较短仅为15 min.结果表明向低电导率PS微球悬浮液施加正弦信号频率为1 MHz时，电压幅值VP-P为9 V富集效果最佳。
图6 在交流信号电压幅值下PS微球最终呈富集状态所需的时间
Fig.6 Time required for PS microspheres to be enriched
at the voltage amplitude of AC signal
2.3 在不同浓度的悬浮液中PS微球的富集实验
在获得频率和电压的最佳参数后，本节研究了不同浓度PS悬浮液的介电泳响应。将PS微球与去离子水配制成一定浓度范围悬浮液，并调节电导率为1 μS/cm.对于极低浓度的分析物溶液，在CCD相机系统下不易观察到PS微球的富集情况，所以配制的分析物溶液浓度应大于105 mL-1(0.16 amol/mL).本文研究主要为后续研究传感器对超低浓度分析物的检测限奠定基础，而高浓度的分析物溶液已具有较强的传感器响应信号，不需要进一步聚集，因此本文未对高浓度PS微球溶液(大于2.08amol/mL)的介电泳效应进行分析。因文章篇幅限制，本文展示了2.08 amol/mL、1.19 amol/mL和0.33 amol/mL这3种浓度下的PS微球悬浮液的实验结果，如图7-图9所示。
采用移液枪将少量浓度为2.08 amol/mL悬浮液注入到电极上，PS微球均匀的分散在电极中心和间隙中如图7(a)所示。施加电压峰值VP-P为9 V、频率为1 MHz的正弦信号，5 min后电极边缘的PS微球受到负介电泳力呈现向电极中心运动的趋势如图7(b)所示，两相邻电极间最先出现PS团簇成点线状，中心富集不明显。保持正弦信号接入到电极上，如图7(c)观察到15 min时PS微球汇聚成点线状，并呈现成星形团簇状态富集在电极中心。继续施加信号，观察到由于微粒间相互作用以及蒸发导致的溶液量减少使得微粒运动缓慢最终停止向中心移动，最终在芯片电极上PS微球富集成星形状。
图7 交流信号频率为1 MHz、电压幅值为9 V，浓度为2.08 amol/mL的PS微球悬浮液在星形电极中心的富集
Fig.7 Enrichment of PS microsphere suspension at the center of star electrode with AC signal frequency of 1 MHz,
voltage amplitude of 9 V and concentration of 2.08 amol/mL
图8 交流信号频率为1 MHz、电压幅值为9 V，浓度为1.19 amol/mL的PS微球悬浮液在星形电极中心的富集
Fig.8 Enrichment of PS microsphere suspension at the center of star electrode with AC signal frequency of 1 MHz,
voltage amplitude of 9 V and concentration of 1.19 amol/mL
当降低浓度为1.19 amol/mL时，施加相同的正弦信号同样可以观察到此富集过程(如图8所示)。对于更低浓度的PS微球悬浮液(0.33 amol/mL)，也可以观察到类似的现象(如图9所示)。结果表明在实验条件相同的情况下，浓度范围在0.33～2.08 amol/mL的PS微球溶液表现出相似的富集效果。
图9 交流信号频率为1 MHz、电压幅值为9 V，浓度为0.33 amol/mL的PS微球悬浮液在星形电极中心的富集
Fig.9 Enrichment of PS microsphere suspension at the center of star electrode with AC signal frequency of 1 MHz,
voltage amplitude of 9 V and concentration of 0.33 amol/mL
3 结论
本文设计并制作了介电泳星形电极芯片，从实验上分析了介质溶液内微粒的富集运动。通过分析临界频率确定低电导率的PS微球悬浮液在1 kHz到10 MHz表现负介电泳响应，验证了在1 MHz时负介电泳力效果最好。当施加交流信号电压幅值VP-P为9 V、频率为1 MHz时，浓度范围在0.33～2.08 amol/mL的样品悬浮液注入到电极上，PS微球在15 min内可以富集到电极中心。在关闭交流信号后，PS微球维持富集状态，为下一步的样品分析奠定基础。本文通过分析电导率、电场频率、幅值信号对PS微球介电泳运动的影响，得到了实现最佳富集效果的实验条件，在生物医药工程中具有广阔的应用前景。
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