随着医疗技术的不断提升，器官替换或组织再生的需求正在迅速扩大，而供体器官的数量远远不够[1]。组织工程在过去几年里得到了更多应用，作为制作仿生微型人体组织模型的工具，目的是提高药物筛选的准确性和促进个性化医学。然而，除了一些简单的器官如皮肤[2]和软骨[3]外，制造复杂的活体组织仍然是一个巨大的挑战。而3D生物打印技术的研究进展，使我们离实现组织工程的宏伟目标又近了一步。原则上，理想的生物墨水应该具有适合生物打印过程的物理化学性质，生物打印后的组织应具有与天然生物组织相似的生物活性及力学性能，而以水凝胶为基础包覆活细胞和生物活性成分的生物墨水最受欢迎[4]。为此，许多基于水凝胶的生物墨水制剂，如明胶甲基丙烯酰基亚胺，丙烯酸酯功能化聚乙二醇，海藻酸钠，琼脂糖和胶原蛋白已被采用，或单独使用或组合使用。
利用明胶作为生物材料，通过共价交联方法克服了明胶在体温下的不稳定性[5]。GelMA是明胶和甲基丙酸酐(MA)反应的产物。除此之外，MA对明胶的化学接枝率会很低，也就意味着大部分RGD基序、MMP可降解基序基本不会受到影响，这将确保GelMA保持良好的细胞黏附性能和降解性[6]。GelMA作为一种性能优异的水凝胶，已被证实可打印成多层网状结构且细胞存活率较高[7]，也可用于组织工程的载细胞构建体[8]。到目前为止，各种基于GelMA的生物墨水已经被开发出来，允许打印出复杂组织结构，可用于人工血管网络结构以及牙周缺损修复材料。因此，GelMA将在生物打印中发挥更重要的作用，以促进功能组织和仿生组织的生成。而通过混合GelMA与其他生物材料制备复合水凝胶来提高其性能也成为当下研究的热点。壳聚糖CS是几丁质的部分去乙酰化衍生物[9]，由于其相当可观的抗菌和止血性能已经被当作组织工程理想的支架材料[10]。明胶与壳聚糖的混合物由于其优异的生物学性能，被制作成各种支架应用于组织工程的众多领域，如皮肤[11]、软骨[12]、骨[13]、神经[14]、肝脏[15]等。
在水凝胶的使用中，物理特性(即孔隙率、弹性模量、降解和水溶胀)的表征，决定其是否适合不同组织工程应用。本研究进行了GelMA前体和ChelMA前体的制备；其次，制备了GelMA及其复合水凝胶(添加ChelMA、PEG(200)DA)，并对其进行力学和物理性能检测，并比较得出适合用于打印人工材料的复合水凝胶。通过制备不同配比的GelMA复合水凝胶，可有效改善GelMA的力学性能，使其满足不同组织器官的机械性能，并调节微观结构(溶胀性和孔隙率)，为今后进一步引入生物活性细胞及应用于不同的活体材料奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
明胶(药用级，购自Solarbio公司)，壳聚糖(脱乙酰度为75%～85%，中分子量，购自Macklin公司)，甲基丙烯酸酐(纯度94%，购自Sigma-Aldrich公司)，PEG(200)DA(购自Sigma-Aldrich公司)，光引发剂Irgacure2959(购自Sigma-Aldrich公司)。本研究所用的试剂和溶液均为试剂级。
1.2 GelMA和ChelMA的合成
GelMA前体合成[16-17]：将10 g明胶溶于100 mL PBS溶液中，磁力搅拌。然后将MA溶液(质量比8%)滴加到上述混合物中，反应2 h后，将混合溶液在去离子水中透析一周，冷冻干燥后得到GelMA前体。将5 g壳聚糖溶解在200 mL醋酸(质量浓度3%)[18]溶液中，磁力搅拌。然后滴加8 mL MA溶液到上述混合物中，反应2 h后，将混合溶液在去离子水中透析一周，冷冻干燥后得到CS-MA前体，本文中将此混合物简称为ChelMA.
1.3 GelMA，GelMA-ChelMA和GelMA-PEG(200)DA水凝胶的制备
称取一定量GelMA前体，分别加入Irgacure 2959水溶液中，在紫外光照射5 min后聚合成质量分数为10%，15%，20%，25%的GelMA.在Irgacure 2959水溶液中加入0.9 g ChelMA前体，制备质量浓度为3%的ChelMA溶液。将GelMA溶液和ChelMA溶液按1∶4，2∶3，1∶1，4∶1，3∶2的体积比例混合，紫外光照射5 min后得到GelMA-ChelMA水凝胶。在GelMA溶液中加入体积分数为30%，40%，50%，60%的PEG(200)DA溶液，紫外光照射5 min后得到GelMA-PEG(200)DA水凝胶[19]。
1.4 FTIR分析
将明胶、GelMA前体、壳聚糖和ChelMA前体冻干，利用Shimadzu FT-IR光谱仪进行红外测试，分辨率为2 cm-1，波数范围为400 cm-1～4 000 cm-1.
1.5 力学性能分析
光固化后的水凝胶用万能试验机分别进行单向压缩试验表征光交联GelMA水凝胶，GelMA-ChelMA复合水凝胶，GelMA-PEG(200)DA复合水凝胶的力学性能。以3 mm/min的位移速率压缩，压缩至原高度的40%.
1.6 SEM分析
将冻干后的GelMA、GelMA-ChelMA水凝胶和GelMA-PEG(200)DA水凝胶切片，喷金，用扫描电子显微镜观察样品表面特征。
1.7 吸水率、溶胀率及交联率分析
取冷冻干燥的GelMA水凝胶、GelMA-ChelMA水凝胶、GelMA-PEG(200)DA水凝胶称重，记为m1.将样品浸泡在PBS溶液中，保温37 ℃，分别在0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 h时取出样品，称重记为m2.计算每个时刻下的吸水率W；之后继续溶胀，24 h后称重记为m3.最后再冷冻干燥，称重记为m4，计算溶胀率S和交联率Y[19].每组做3次实验，取平均值。
(1)
(2)
Y=(m4-m1)×100% .
(3)
1.8 孔隙率分析
取冷冻干燥的GelMA水凝胶、GelMA-ChelMA水凝胶、GelMA-PEG(200)DA水凝胶在无水乙醇中浸泡，不发生溶胀行为，用乙醇置换的方法测定孔隙率[20]。方法如下：取干态水凝胶称重，记为md，用无水乙醇浸没样品，用真空泵进行抽真空，直到干态水凝胶沉底，取出称重为ms，计算孔隙率q.
(4)
式中：ρ是乙醇在24.5 ℃时的密度(0.79 g/mL)；V是支架的体积。每组3个样品，取平均值。
2 结果与讨论
2.1 GelMA，GelMA-ChelMA和GelMA-PEG(200)DA水凝胶的合成
紫外光下，光引发剂形成自由基，与GelMA、ChelMA上的光敏性甲基丙烯酰胺基团的双键发生反应，使GelMA、ChelMA上带有自由基，之后进行自由位点的转移，进攻GelMA、ChelMA上游离的甲基丙烯酰胺基团双键，直至共聚反应终止，最后形成交联分子链。明胶虽然含有大量的氨基，但是进行丙烯酰化的位点却很少，所以在发生酰化反应后，分子上光敏性基团也很少。其次，明胶属于大分子，空间位阻较大，会降低GelMA的交联率。所以在GelMA中添加小分子量的PEG(200)DA，空间位阻会小；除此之外，加入PEG(200)DA使反应体系中双键数量增加，交联点随之也会增加，最后生成三维网络聚合物。PEG(200)DA的加入，能够提供更多活性基团，使水凝胶交联度提高，解决单纯GelMA光交联存在的问题。
从水凝胶合成图可以看出，水凝胶呈现果冻状，颜色为淡乳白色且渗透着淡黄色。如图1(a)从左到右依次为质量分数10%、15%、20%、25%的GelMA，随着浓度的增加，水凝胶的颜色变得越来越黄。图1(b)从左到右依次为GelMA和ChelMA体积比为1∶4，2∶3，1∶1，3∶2，4∶1，随着体积比的增大，水凝胶的浅黄色逐渐变浅。图1(c)从左到右依次为GelMA中加入体积分数30%，40%，50%，60%的PEG(200)DA，随着PEG(200)DA的体积分数逐渐增加，水凝胶的颜色也逐渐变白。
图1 (a) 不同质量分数的GelMA；(b) 不同体积比的GelMA和ChelMA；(c) 不同体积分数的GelMA-PEG(200)DA
Fig.1 (a) Different concentrations of GelMA；(b) Different ratios of GelMA to ChelMA；
(c) Different concentrations of GelMA-PEGDA
2.2 FTIR分析
图2(a)FTIR光谱显示，明胶酰胺A带3 284 cm-1，酰胺B带3 069 cm-1；酰胺Ⅰ带1 634 cm-1主要由C
O伸缩振动引起；酰胺Ⅱ带1 534 cm-1是由C—N伸缩振动、N—H弯曲振动共同引起。酰胺Ⅲ带1 234 cm-1主要由CH2摇摆振动、N—H弯曲振动和C—N伸缩振动共同引起。GelMA前体与明胶的峰型极其相似，只是酰胺Ⅱ带略微向高频移动原因在于明胶分子链上引入了甲基丙烯酰胺基[19，21]。图2(b)看出：壳聚糖酰胺Ⅰ带1 648 cm-1，主要是CO伸缩振动峰；酰胺Ⅱ带1 586 cm-1，是N—H平面振动峰；1 150 cm-1处为氨基。ChelMA前体与壳聚糖的峰型相似，只是酰胺Ⅱ带稍微向低频移动原因在于引入了甲基丙烯酰胺基。ChelMA前体的特征峰1 648 cm-1(酰胺Ⅰ带)，1 531 cm-1(酰胺Ⅱ带)，1 150 cm-1(氨基)。
图2 (a) GelMA和明胶的红外光谱；(b) ChelMA
和壳聚糖的红外光谱
Fig.2 (a) FTIR spectra of GelMA and Gelatin；(b) FTIR
spectra of ChelMA and CS
2.3 SEM表征结果
根据3种水凝胶的SEM图像(如图3所示)显示，其表面结构存在很大的不同。由图3可知：GelMA水凝胶质量浓度的增加对其孔洞大小无明显影响。而GelMA-ChelMA的孔状结构几乎全被一层膜遮盖，并且随着CS浓度的减小，孔洞更大，孔壁更厚，说明更多的大分子链被缠绕和结合在一起。加入PEG(200)DA后，水凝胶表面孔隙结构与另两种材料有区别，结构表面仍呈现孔状结构，但表面的孔比较粗糙，可能是由于材料韧性断裂而引起。
图3 不同水凝胶的SEM表征
Fig.3 Morphology of various hydrogels
2.4 力学性能分析
图4为GelMA，GelMA-ChelMA和GelMA-PEG(200)DA水凝胶的典型压缩曲线和弹性模量值。图4可见随着GelMA质量浓度的增加弹性模量也增加，且增加较明显。GelMA与ChelMA体积比增大，弹性模量减小，但是减小不明显。说明在GelMA中添加ChelMA，可以增强力学性能。随着PEG(200)DA体积分数的增大，弹性模量显著增大。相较于GelMA水凝胶、GelMA-ChelMA复合水凝胶，GelMA-PEG(200)DA复合水凝胶的弹性模量很大，是因为加入PEG(200)DA使GelMA分子链之间的交联密度增大从而起到了类似交联剂的作用[19]，说明PEG(200)DA的加入，可以显著增强力学性能。图4显示，虽然加入PEG(200)DA的水凝胶弹性模量会增大，但是变得更易破坏，在应变为30%左右发生破坏。
图4 三种水凝胶的机械性能
Fig.4 Mechanical behaviors of three hydrogels
2.5 吸水率、溶胀率及交联率分析结果
图5显示，随着时间的增加，3种水凝胶都是在0.5 h内吸水最快，虽然0.5 h之后吸水率仍在增大，但变化很小，慢慢趋于稳定。GelMA质量浓度升高，吸水率减小。GelMA与ChelMA的体积比变大，吸水能力变弱。PEG(200)DA体积分数增大，吸水率减小。GelMA-PEG(200)DA复合水凝胶的吸水率普遍低于GelMA水凝胶、GelMA-ChelMA复合水凝胶。质量分数10%的GelMA水凝胶吸水率高于3∶2，4∶1(GelMA与ChelMA体积比)的GelMA-ChelMA复合水凝胶；质量分数15%，20%，25%的GelMA水凝胶吸水率均低于GelMA-ChelMA复合水凝胶的吸水率。
图5 各种水凝胶的吸水率
Fig.5 Water absorption of various hydrogels
表1显示，GelMA溶液中添加ChelMA和PEG(200)DA，可以一定程度上提高水凝胶的交联率，也可以一定程度上降低溶胀率；GelMA-PEG(200)DA复合水凝胶的溶胀率，显著低于GelMA水凝胶和GelMA-ChelMA复合水凝胶，说明添加PEG(200)DA后，可以改善水凝胶的溶胀性。Gel-MA质量浓度升高，溶胀率减小，交联率也减小，可能是由于明胶的分子量大，浓度增高使其空间位阻增大导致。GelMA和ChelMA体积比增大，溶胀率和交联率都减小。ChelMA和GelMA上的紫外光引发活性中心都比较少，交联反应受到影响，随之降低。PEG(200)DA体积分数的增大，交联率增大，溶胀率降低。PEG(200)DA中双丙烯酸酯基团的增加使交联点增加，随之交联率就会增加。
表1 三种水凝胶的物理特性
Table 1 Physical properties of three hydrogels %
组别溶胀率交联率10%G9.93±0.5892.25±2.7215%G8.69±0.3191.63±0.6520%G7.43±0.5683.41±1.5225%G6.75±0.5672.76±8.67G1C411.45±0.3697.15±0.81G2C310.19±0.3396.57±0.44G1C18.95±0.1495.80±0.17G3C28.36±0.1794.85±0.79G4C17.99±0.2888.88±0.7630%P3.44±0.1491.62±0.8540%P2.99±0.0592.65±1.8850%P2.41±0.0494.04±0.6360%P2.06±0.0895.26±1.05
2.6 孔隙率分析
由图6可知，GelMA质量分数的增加，孔隙率减小，说明GelMA水凝胶质量浓度越大，形成的三维网状结构更加的紧密。GelMA与ChelMA的体积比增大，孔隙率减小，但是减小不明显，但仍可以说明加入ChelMA会影响GelMA水凝胶的孔隙率，会使GelMA水凝胶更加紧密。PEG(200)DA体积分数的增大，孔隙率减小，是因为PEG(200)DA的加入使GelMA分子之间的连接更加紧密。
图6 各种水凝胶的孔隙率
Fig.6 Poriness of various hydrogels
3 结论
综上所述，在GelMA中加入ChelMA和PEG(200)DA，以满足不同组织和器官的力学性能。弹性模量增大，吸水率、溶胀率、交联率、孔隙率、表面形貌和结构均受到一定影响。特别是GelMA-PEGDA水凝胶，弹性模量显著增加，吸水率和溶胀率显著降低。PEG(200)DA的加入加快了反应速率，使单体在短时间内转化为聚合物，也提高了GelMA水凝胶分子之间的交联度。水在这个聚合网络中的扩散速率会减慢，导致吸水率显著降低。ChelMA和GelMA的紫外激活中心较少，光交联效率较低，而PEGDA中的双丙烯酸基团提高了交联度。通过在GelMA中加入壳聚糖和PEG(200)DA，可以得出最适宜的GelMA与ChelMA和PEG(200)DA的各种比例，来满足多种生物医学应用的多样化需求，以及满足生物打印的多种需求，也提高GelMA了作为生物医用材料的应用需求。
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