圆锥角膜(Keratoconus)是一种角膜扩张性疾病，其主要特征是角膜中央变薄向前突出呈圆锥形，进而导致不规则散光和近视，影响视觉。圆锥角膜的发生机制尚不清楚。胶原是角膜细胞外基质的主要成分，承担角膜的主要抗张强度。圆锥角膜中胶原含量和结构发生改变，角膜生物力学性能降低[1]。胶原蛋白的合成与降解异常是圆锥角膜发生的可能机制之一。与正常角膜相比，圆锥角膜患者基质层中胶原蛋白含量显著降低，胶原降解相关蛋白基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表达增加[1-2]。RNA测序和多重质谱分析结果显示圆锥角膜中胶原合成、成熟以及分解代谢途径发生变化，胶原合成基因的表达降低[3-5]。
圆锥角膜通常被认为是一种非炎性疾病，但研究发现圆锥角膜患者泪液中促炎因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素(Interleukin，IL)-1/-4/-5/-6/-17、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)等均显著高于正常人[5-9]，表明炎症反应参与了圆锥角膜的发生。NISHTALA et al[8]推测炎症是圆锥角膜基质畸形的决定性因素。炎性因子在角膜组织修复机制中发挥着重要的作用，角膜基质细胞中炎性因子释放增加可能导致基质降解和基质细胞凋亡[10-11]，破坏角膜组织的结构和微环境，使角膜组织稳态失衡，促进圆锥角膜发生发展。
IL-8又称趋化因子CXCL8，可调节细胞迁移、细胞黏附以及血管生成等生理过程[12-13]。IL-8介导趋化反应和炎症反应，参与角膜炎、角膜溃疡、角膜瘢痕等多种眼部疾病的发生[14-15]。GHOSH et al[16]发现IL-8在圆锥角膜患者泪液中有较高含量，但其作用的分子机制还需进一步研究。
本研究通过siRNA干扰正常角膜成纤维细胞中IL-8的表达，采用实时荧光定量PCR、Western blot、ELISA、明胶酶谱等方法分析IL-8对胶原合成和降解的影响，探讨IL-8调节角膜成纤维细胞胶原代谢的信号途径，为揭示圆锥角膜的发病机制提供参考。
1 实验材料和方法
1.1 角膜成纤维细胞的提取及培养
从山西省眼科医院获得角膜移植手术后废弃的正常人角膜组织，经0.5 mg/mL Ⅱ型胶原酶消化后，离心，弃上清，加入成纤维细胞培养基(fibroblast medium，FM)(含体积分数2%胎牛血清，体积分数1%成纤维细胞生长因子，体积分数1%青霉素/链霉素)(ScienCell，USA)，于37 ℃、CO2体积分数5%的细胞培养箱内进行培养，当细胞融合率达到90%时进行传代及冻存，传代3～4次的细胞用于后续siRNA转染。
1.2 siRNA序列的设计及细胞转染
设计并合成针对人IL-8基因(Genbank NO.NM_000584)编码区的3对靶向siRNA序列和对照序列(无特异性靶序列)(Gene Pharma，上海)，序列如表1所示。将提取的正常人角膜成纤维细胞以105个细胞/孔的密度接种于24孔培养板上，当细胞融合率达到70%～90%时，采用脂质体(Lip-2000，Invitrogen)转染法将siRNA导入角膜成纤维细胞，siRNA最终浓度为80 nmol/L.转染后36 h收集细胞用于基因表达分析，转染72 h后收集细胞和上清，进行Western blot、ELISA、明胶酶谱等蛋白水平检测。
表1 siRNA序列
Table 1 siRNA sequences
siRNA序列Control5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'si-IL8-15'-GCCAAGGAGUGCUAAAGAATT-3'si-IL8-25'-GCGCCAACACAGAAAUUAUTT-3'si-IL8-35'-GCUAGAAUGUGAUAUUUGATT-3'
1.3 实时荧光定量PCR(qPCR)检测基因表达
收集的细胞中加入细胞裂解液，采用EastepSuper总RNA提取试剂盒(Promega，上海)提取总RNA.以提取的总RNA为模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒(Takara，大连)说明书将RNA反转录成cDNA.根据GenBank中的序列，使用Primer 6.0 软件设计引物并由上海生工生物工程公司合成，引物名称及序列如表2所示。以合成的cDNA为模板，通过qPCR(SYBR染料法，TB GreenTMPremic Ex TaqTM Ⅱ)(Takara，大连)检测促炎因子基因(IL-8，IL-6，IL-1β)、胶原合成基因(COL1A2，COL3A1，COL5A3，COL6A1)、胶原降解相关基因MMP-2、血管内皮生长因子及其受体基因(VEGFA、VEGFR2)的表达，以管家基因GAPDH作为内参，目标基因的相对表达量采用相对定量法进行分析。
表2 qPCR引物
Table 2 List of Primers for qPCR
基因引物序列产物长度/bpGenbank登录号GAPDHF 5'-ATTCCATGGCACCGTCAAGG-3'107NM_001289746R 5'-CAGCATCGCCCCACTTGATT-3'IL-8F 5'-CCAGGAAGAAACCACCGGAAG-3'122NM_000584R 5'-TGGCAAAACTGCACCTTCACA-3'COL1A2F 5'-CCCTGGCAGAGATGGTGCTCG-3'163NM_000089R 5'-GGGGCCAGCAGGACCGACC-3'COL3A1F 5'-GGTGCTAATGGTGCTCCTGGACTG-3'105NM_000090R 5'-AATACCAGCCTCACCGCGTTCAC-3'COL5A3F 5'-GACGAAGCCACGGGTGACTACA-3'188NM_015719R 5'-TCCCACAGGGGCAGAAATCC-3'COL6A1F 5'-ACTTTATCAACGACGCCACCG-3'203NM_001848R 5'-GCCCACGACCACCACGAA-3'MMP-2F 5'-CGGAAAGATGTGGTGTGCGA-3'202NM_001302510R 5'-GTCATCCTGGGACAGACGGA-3'IL-6F 5'-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3'123NM_000600R 5'-CTTGGGGTTCTTGCTGATGT-3IL-1βF 5'-CAACAGGCTGCTCTGGGATTC-3'100NM_000576R 5'-AGCCATCATTTCACTGGCGA-3'VEGFAF 5'-GACTGCTGTGGACTTGAGTTGGG-3'201NM_001287044R 5'-GGGCTGGGTTTGTCGGTGTT-3'VEGFR2F 5'-TGCCTACCTCACCTGTTTCCTGT-3'114NM_002253R 5'-GGCTCTTTCGCTTACTGTTCTGC-3'
1.4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测总胶原含量
收集转染72 h后细胞培养液上清，采用BCA蛋白定量试剂盒(凯基生物，南京)检测蛋白浓度，采用ELISA法按照Human Col ELISA试剂盒(江莱生物，上海)说明书检测细胞上清中的总胶原含量。
1.5 明胶酶谱检测MMP-2活性
细胞培养液上清蛋白定量后通过含体积分数5%明胶的SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)(体积分数10%)电泳分离，将凝胶转移至体积分数2.5% Triton-X 100溶液中，震荡洗涤3次，加入蛋白孵育液(50 mmol/L CaCl2，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris)37 ℃孵育16 h，凝胶置于考马斯亮蓝R250染色液中染色30 min后换至脱色液(体积分数40%甲醇，体积分数7.5%冰醋酸)中进行脱色，直至出现透明条带。用Image J 1.8.0软件进行灰度值分析。
1.6 Western blot检测蛋白的表达
收集的细胞加入RIPA裂解液(Solarbio，北京)冰上裂解1 h后离心，收集上清，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将定量的蛋白(50 ng)加入蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴变性5 min，离心取上清，进行Western blot分析。样本经体积分数10% SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜(Millipore，美国)，质量分数5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，洗膜。分别加入鼠抗人IL-8抗体(1∶500)、AKT抗体(1∶500)、ERK1/2抗体(1∶500)、β-Actin抗体(1∶500)(Servicebio，武汉)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜5 min，加入与辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠二抗(1∶5 000)(Servicebio，武汉)室温孵育1 h，使用ECL检测试剂压片曝光，以β-Actin作为内参，用Image J 1.8.0软件以相对灰度值进行定量。
1.7 数据分析
每组实验重复3次，数据用平均值±SD表示，使用Origin Pro 9.1作图，使用SPSS 17.0软件单因素方差分析(ANOVA)进行统计学分析。P<0.05表明样本间有显著性差异。
2 结果
2.1 IL-8 siRNA干扰效率
针对人IL-8基因(Genbank NO. NM_000584)编码区设计3对特异性靶向siRNA序列，分别转染人角膜成纤维细胞，通过分析干扰后IL-8基因的表达检测siRNA干扰效率。结果显示(图1(a))，与对照组(无特异性靶序列)相比，转染IL-8特异性siRNA序列后角膜成纤维细胞中IL-8基因的表达均被显著抑制，其中si-IL8-1片段的干扰效率最高(98.9%，P<0.05).进一步利用Western blot检测si-IL8-1片段干扰后IL-8蛋白的表达变化(如图1(b)所示)，结果显示，si-IL8-1片段转染后IL-8的蛋白表达量显著下降，约为对照组的69%(P<0.05).因此后续实验使用si-IL8-1片段干扰人角膜成纤维细胞中的IL-8的表达。
*代表与对照组有显著性差异，P<0.05
图1 角膜成纤维细胞中IL-8 siRNA干扰效率
Fig.1 Efficiency of IL-8 siRNA interference in corneal fibroblasts
2.2 IL-8对人角膜成纤维细胞胶原合成基因表达及胶原含量的影响
采用qPCR法检测干扰IL-8后，角膜成纤维细胞中胶原合成基因COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1的表达，结果如图2(a)所示，干扰IL-8后COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1基因的表达均显著上升，分别为对照组的2.27，1.64，2.57，2.94，1.21倍(P<0.05).进一步采用ELISA法检测干扰IL-8对角膜成纤维细胞外总胶原含量的影响，结果如图2(b)所示，IL-8 siRNA转染组总胶原的含量为对照组的9.2倍(P<0.05).降低角膜成纤维细胞中IL-8基因的表达能够显著提高总胶原的含量。
*代表与对照组有显著性差异，P<0.05
图2 沉默IL-8对角膜成纤维细胞胶原合成基因
表达(a)和胶原含量(b)的影响
Fig.2 Effect of IL-8 silence on collagen synthesis gene expression
(a) and collagen content (b) in corneal fibroblasts
2.3 IL-8对人角膜成纤维细胞MMP-2基因表达及活性的影响
与对照组相比，干扰IL-8后角膜成纤维细胞中明胶酶基因MMP-2的表达显著下降(图3(a)，下降43%，P<0.05).在此基础上，通过明胶酶谱分析MMP-2的活性变化，结果如图3(b)，与对照组相比，IL-8干扰后MMP-2的活性下降20%(P<0.05).
2.4 IL-8对下游信号途径表达的影响
如图4(a)所示，干扰IL-8后角膜成纤维细胞中VEGF-A(VEGFA)及其受体VEGFR2基因表达降低(P<0.05)，进一步采用Western blot法检测VEGFR2下游AKT与ERK1/2信号途径的变化，结果如图4(b)所示，与对照组相比，干扰IL-8后角膜成纤维细胞中AKT和ERK1/2蛋白的表达均显著下降(P<0.05).
*代表与对照组有显著性差异，P<0.05
图3 IL-8对角膜成纤维细胞MMP-2基因表达
(a)及蛋白活性(b)的影响
Fig.3 Effect of IL-8 on MMP-2 gene expression (a) and
protein activity (b) in corneal fibroblasts
*代表与对照组有显著性差异，P<0.05
图4 干扰IL-8对下游信号途径的影响
Fig.4 Effect of IL-8 interference on downstream
signaling pathways
2.5 IL-8对其他促炎因子表达的影响
通过qPCR法检测干扰IL-8后，角膜成纤维细胞中促炎因子基因IL-1β、IL-6的表达变化，结果如图5显示，IL-1β、IL-6的表达均显著降低，与对照组相比，IL-8干扰组中IL-1β、IL-6基因的相对表达量分别下降为93%，50%(P<0.05).
*代表与对照组有显著性差异，P<0.05
图5 IL-8对角膜成纤维细胞促炎因子基因表达的影响
Fig.5 Effect of IL-8 on the gene expression of other
inflammatory factors in corneal fibroblasts
3 讨论
尽管圆锥角膜被认为是一种非炎性疾病，但越来越多的研究者发现圆锥角膜患者泪液中促炎因子含量显著升高[5-9,17]。ELISA检测结果显示圆锥角膜患者角膜细胞和泪液中IL-6、IL-8的含量较高[18]；LOH et al[19]采用细胞因子抗体芯片对圆锥角膜样本进行分析发现：IL-1等炎性因子在圆锥角膜中含量显著升高，炎症相关信号途径被激活，圆锥角膜可能是一种慢性炎症性角膜疾病。作为一种重要的促炎因子，IL-8在圆锥角膜中的作用尚不明确。
圆锥角膜中胶原的形态和排列发生改变，胶原蛋白的合成和降解失衡，进而导致角膜生物力学性能下降，抗变形能力降低。COLs、MMPs等与胶原代谢相关的基因是圆锥角膜可能的易感基因[20]。圆锥角膜中胶原合成基因COL1、COL5A2、COL6A1的表达降低[5]。对圆锥角膜组织进行质谱、免疫组化等分析发现，圆锥角膜中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型胶原蛋白含量显著减少[2，21]。本研究通过siRNA干扰角膜成纤维细胞中IL-8的表达，探讨IL-8在角膜成纤维细胞胶原代谢过程中的作用，结果发现，干扰IL-8的表达能够诱导角膜成纤维细胞中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型胶原合成基因COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1的表达，总胶原含量升高，表明IL-8负调控角膜成纤维细胞中胶原的合成。MMP-2参与胶原蛋白的降解，在圆锥角膜中具有较高的表达[1，11]。本研究结果显示，降低IL-8的表达后角膜成纤维细胞中MMP-2基因的表达及酶活性均降低，表明IL-8参与角膜成纤维细胞中MMP-2介导的胶原降解过程。
研究表明，在口腔角质形成细胞中IL-1β、IL-6与IL-8共表达[22]。IL-1β、IL-6等炎症因子可以促进角膜成纤维细胞中MMPs的表达[23-25]。本研究结果显示，干扰IL-8可显著降低IL-1β、IL-6两种促炎因子表达，推测IL-8可通过调节其他促炎因子的表达调节角膜成纤维细胞中胶原的合成和降解。血管内皮生长因子(VEGF)可以激活其同源酪氨酸激酶受体VEGFR2从而促进细胞的增殖、存活和迁移。研究发现，IL-8通过激活PI3K/AKT通路促进结肠癌细胞增殖和迁移[26]。同时，IL-8也可以通过作用于其受体CXCR2来上调内皮细胞中的VEGF的基因和蛋白水平，并导致VEGFR2的自分泌激活[27]。VEGF可以影响内皮细胞中细胞信号转导和炎性反应密切相关的ERK1/2信号通路[28]；此外，VEGF通过PI3K/AKT信号通路促进胎盘间充质干细胞的增殖和生长[29]；SONG et al[30]发现PI3K/AKT信号通路参与肾脏组织中Ⅰ型胶原的表达调控。本研究结果显示，干扰角膜成纤维细胞中IL-8的表达后，VEGFA及其受体VEGFR2的基因表达降低，其下游途径关键蛋白AKT、ERK1/2的表达均显著下降。表明IL-8调节角膜成纤维细胞中VEGF的表达，并通过PI3K/AKT、ERK信号通路负调控角膜成纤维细胞中胶原的合成，参与MMP-2介导的胶原降解过程(图6).
图6 IL-8在角膜成纤维细胞中作用的信号通路
Fig.6 Proposed signaling pathway of IL-8 in corneal fibroblasts
本研究探讨了正常角膜成纤维细胞中IL-8对胶原代谢的作用及其分子机制，IL-8及其下游信号通路在圆锥角膜病变中的作用还需进一步研究，本研究结果可为深入揭示圆锥角膜的发病机理提供参考。
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