圆锥角膜(keratoconus，KC)是一种进行性角膜变薄疾病，可引起不规则散光和视力下降，由遗传因素[1]和环境因素(如揉眼、佩带角膜接触镜、紫外线损伤等)[2]多种因素共同造成。
角膜基质组织更新代谢的速率较慢，由于长期暴露在紫外线下，容易受到自由基和活性氧的破坏，引起氧化应激水平的升高[3]。研究发现圆锥角膜患者离体角膜中含有过氧亚硝酸盐和丙二醛的生化标记物，导致一氧化氮和脂质过氧化的形成[4]。TOPRAK et al[5]发现，与正常受试者相比，圆锥角膜患者血清总氧化水平及氧化应激指标显著升高。氧化应激导致圆锥角膜组织退化[6]、基质变薄和鲍曼层缺失[7]。此外，超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase-2，SOD-2)、抗氧化酶血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和 NADPH氧化还原酶(NADPH quinine oxidoreductase-1，NQO-1)3种常见的抗氧化酶，是氧化应激反应中的关键指标，先前的研究发现，正常人和圆锥角膜患者细胞中SOD-2、HO-1和NQO-1的表达不同[8]。
氧化应激可引起炎症，促进炎性因子的释放，参与动脉粥样硬化和肺损伤等疾病的发生发展[9-10]。研究发现圆锥角膜患者泪液中存在肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、白介素(interleukin，IL)-1/-4/-5/-6/-8/-17等炎性因子，表明圆锥角膜的发生发展与慢性炎症密切相关[11-12]。组织损伤后，适当的炎症反应能够促进组织修复，但炎性因子多度或长期存在则会导致细胞凋亡、坏死和纤维化，最终造成组织结构破坏和功能衰退[13]。目前圆锥角膜中的炎性因子的来源尚不清楚。
本文通过对圆锥角膜患者角膜成纤维细胞添加过氧化氢，探讨了氧化应激对HO-1、SOD-2、NQO-1、炎性因子(ICAM-1、IL-1β/-6/-8)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1/-3、Ⅰ型胶原-α2(Collagen Ⅰ-α2)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1/-2/-3、赖氨酰氧化酶样蛋白(lysyl oxidase like，LOXL)-1/-3/-4基因表达的影响，以及氧化应激在圆锥角膜发病中的作用，这将有助于更好地理解圆锥角膜发病机制，为临床圆锥角膜的诊治提供参考。
1 实验材料和方法
1.1 主要试剂
成纤维细胞培养基(Gibico，美国)、胰蛋白酶(Gibico，美国)、Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)、过氧化氢(上海碧云天)、TRIZOL及 Prime-ScriptTMRT reagent Kit 检测试剂(Takara，大连)、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)(Sigma，美国)。
1.2 人角膜成纤维细胞的提取及培养
两例圆锥角膜患者角膜组织取自山西省眼科医院，均为角膜移植术后废弃的病理组织。机械剥离角膜上皮和内皮层，磷酸缓冲盐溶液反复清洗后，用含 1 mg/mL Ⅱ型胶原酶的培养基消化，直至组织块完全消失，镜下可见单个细胞时终止消化。2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入成纤维细胞培养基(含体积分数为2%胎牛血清、1%体积分数为青/链霉素、1%体积分数为成纤维细胞生长因子)，并置于37 ℃、体积分数5% CO2孵箱内培养，本实验采用2～4代的细胞。
1.3 过氧化氢处理
采用浓度为100 μmol/L过氧化氢处理细胞4 h，以未做任何处理的细胞作为对照。处理结束后，磷酸缓冲盐溶液清洗，分别用TRIZOL裂解细胞，收集RNA.
1.4 荧光实时定量PCR检测抗氧化酶基因表达
收集细胞裂解液，提取总RNA，使用Prime-ScriptTMRT reagent Kit试剂盒进行反转录获得cDNA.采用荧光实时定量PCR(StepOne Plus，ABI，美国)检测SOD-2、HO-1、NQO-1、IL-1β/-6/-8、ICAM-1、MMP-1/-3、TIMP-1/-2/-3、Collagen I -α2、 LOXL-1/-3/-4 mRNA表达，并以管家基因GAPDH作为内参。人目标基因引物序列见表1.PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，35个循环。采用2-ΔΔCT法对基因表达进行相对定量分析。
表1 人目标基因引物序列
Table 1 Human target gene primer sequence
基因引物序列GAPDHForward5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'Reverse5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'SOD-2Forward5'-CCTAACGGTGGTGGAGAACC-3'Reverse5'-CTGAGCCTTGGACACCAACA-3'HO-1Forward5'-CAGTGCCACCAAGTTCAAGC-3'Reverse5'-CTGGATGTTGAGCAGGAACG-3'NQO-1Forward5'-AAGCCGCAGACCTTGTGATA-3'Reverse5'-TGGCAGCGTAAGTGTAAGCA-3'IL-1βForward5'-CCAGGAGAATGACCTGAGCA-3'Reverse5'-GGAGCGTGCAGTTCAGTGAT-3'IL-6Forward5'-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3'Reverse5'-CTTGGGGTTCTTGCTGATGT-3'IL-8Forward5'-CCAGGAAGAAACCACCGGAAG-3'Reverse5'-TGGCAAAACTGCACCTTCACA-3'ICAM-1Forward5'-GTCACCTATGGCAACGACTCCTTC-3'Reverse5'-AGTGTCTCCTGGCTCTGGTTCC-3'LOXL-1Forward5'-TGCCACCAGCATTACCACAG-3'Reverse5'-GAGGTTGCCGAAGTCACAGG-3'LOXL-3Forward5'-CAACAGGAGGTTTGAACGCTAC-3'Reverse5'-GCTGACATGGGTTTCTTGGTAA-3'LOXL-4Forward5'-TTCACCCACTACGACCTCCTCA-3'Reverse5'-CAGCAGCCTACAGTCACTCCCT-3'MMP-1Forward5'-GAGGAAAATTCCAAAGCAGAGAGG-3'Reverse5'-GGAGTGAGGACGAACTGAGCCA-3'MMP-2Forward5'-CGGAAAGATGTGGTGTGCGA-3'Reverse5'-GTCATCCTGGGACAGACGGA-3'MMP-3Forward5'-GTGCGTGGCGCTTTGCTCAG-3'Reverse5'-GCCACACCTGGGCTTGCGTA-3'TIMP-1Forward5'-CCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAG-3'Reverse5'-AAGGTGGTCTGGTTGACTTCTGGT-3'TIMP-2Forward5'-GCCAAAGCGGTCAGTGAGAA-3'Reverse5'-TGATGTGCATCTTGCCGTCC-3'TIMP-3Forward5'-GATGGCAAAAGCAAAACAAAATG-3'Reverse5'-GACAGCAGACTGGCTAAAGGGA-3'Collagen Ⅰ-α2Forward5'-CAATCACGCCTCTCAGAACA-3'Reverse5'-TCGGCAACAAGTTCAACATC-3'
1.5 数据统计分析
实验结果以均值±标准差表示，采用SPSS 20.0统计分析软件进行统计学分析，两组间比较采用t检验分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。
2 实验结果
2.1 氧化应激对角膜成纤维细胞抗氧化酶基因表达的影响
氧化应激可显著上调KC细胞中抗氧化酶基因表达，如图1所示，与未处理组相比，氧化应激条件下KC1和KC2细胞HO-1基因表达水平均升高，相对表达量分别是对照组的2.1和1.88倍(P<0.05)；NQO-1基因表达水平也均升高，KC1和KC2细胞中NQO-1相对表达量分别是对照组的1.37和1.32倍(P<0.05)；SOD-2基因表达与前两者相似，分别是对照组的1.86和1.92倍(P<0.05).
*P<0.05，与各自对照组比较
图1 过氧化氢对圆锥角膜成纤维细胞抗氧化酶基因表达的影响
Fig.1 Effects of H2O2on the gene expression of antioxidant enzymes in hKCFs
2.2 氧化应激对角膜成纤维细胞炎性因子基因表达的影响
如图2所示，与未处理组相比，氧化应激使KC1和KC2细胞中IL-1β基因表达显著升高，分别为对照组的16.57和7.56倍(均P<0.05)；IL-6、IL-8基因表达与IL-1β类似，IL-6表达分别为对照组的7.51和3.34倍(均P<0.05)；IL-8表达分别为对照组的3.72和1.45倍(均P<0.05)；ICAM-1基因表达不同，KC1细胞ICAM-1基因表达为对照组的1.83倍(均P<0.05)，KC2细胞则无显著变化(P>0.05).
2.3 氧化应激对圆锥角膜成纤维细胞MMPs和TIMPs基因表达的影响
如图3所示，氧化应激条件下，KC1和KC2细胞MMP3基因表达均高于对照组，分别为对照组的1.86和1.92倍(均P<0.05)；KC1细胞MMP-1基因表达高于对照组细胞，为对照组的1.32倍(P<0.05)；而KC2细胞无显著变化(P>0.05)；MMP-2基因表达二者均无显著变化。
*表示P<0.05，与各自对照组比较
图2 过氧化氢对圆锥角膜成纤维细胞炎性因子基因表达的影响
Fig.2 Effects of H2O2on the gene expression of inflammatory cytokines in hKCFs
氧化应激使KC1、KC2细胞TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3基因表达均显著下调。与各自的空白对照组比较，TIMP-1分别降低了14%和15%(均P<0.05)；TIMP-2分别降低了12%(P<0.05)和6%(P>0.05)；TIMP-3分别降低了33%和11%(均P<0.05).
2.4 氧化应激对角膜成纤维细胞Collagen Ⅰ和LOXLs基因表达的影响
如图4所示，与未处理组相比，氧化应激使KC1和KC2细胞CollagenⅠ-α2基因表达均下调，与对照组相比，分别降低了10%和26%(均P<0.05)；LOXL-4和LOXL-1表达与CollagenⅠ-α2相似，与对照组相比，LOXL-1分别降低了43%和16%(均P<0.05)，LOXL-4分别降低了47%和33%(均P<0.05)；LOXL-3表达略有不同，KC1细胞下降了14%(P<0.05)，而KC2细胞上调了11%(P>0.05).
3 讨论
氧化应激和抗氧化的平衡调节是抵御多种疾病和人体进行自我保护的重要途径，参与内环境稳态以及维持人体正常生理功能的调节。研究发现圆锥角膜患者角膜细胞、角膜组织甚至整个机体内ROS水平均偏高，导致角膜处于氧化应激状态[4-7]。目前氧化应激在圆锥角膜中的作用尚不清楚。本文主要探索了氧化应激对圆锥角膜成纤维细胞、炎性因子及基质重塑相关基因表达的影响。
当机体持续产生自由基时，抗氧化酶促防御系统被激活，通过降低活性氧水平，维持体内氧化与抗氧化动态平衡，从而防止细胞发生氧化损伤[14]。关于圆锥角膜细胞抗氧化酶表达的报道并不一致。边江等[15]研究发现，圆锥角膜成纤维细胞中抗氧化酶SOD2、HO-1、NQO-1的表达较正常人显著下降，过氧化氢处理后表达量未见明显变化；笔者前期研究发现，与正常人相比，部分圆锥角膜成纤维细胞的HO-1和NQO-1显著降低，而部分圆锥角膜成纤维细胞HO-1和SOD2则显著增高，机械牵拉可引起ROS升高，但不同圆锥角膜患者抗氧化酶表达不同[8]。ATILANO et al[16]发现圆锥角膜成纤维细胞SOD1表达下降，而SOD2表达上升。本文研究发现过氧化氢可使圆锥角膜成纤维细胞SOD2、HO-1和NQO-1表达均增加。说明部分圆锥角膜患者发病与抗氧化系统活化缺陷有关，而部分患者抗氧化酶系统工作正常，但ROS/RNS清除机制障碍，亦可引起细胞损伤。报道的结果差异与患者病程和病因不同以及样本量有关，同时也提示了圆锥角膜发病机制的多样性和复杂性。
*表示P<0.05，与各自对照组比较
图3 过氧化氢对圆锥角膜成纤维细胞MMPs和TIMPs基因表达的影响
Fig.3 Effects of H2O2on the gene expression of MMPs and TIMPs in hKCFs
*表示P<0.05，与各自对照组比较
图4 过氧化氢对圆锥角膜成纤维细胞Collagen Ⅰ和LOXLs基因表达的影响
Fig.4 Effects of H2O2on the gene expression of Collagen Ⅰ and LOXLs in hKCFs
研究显示圆锥角膜患者泪液和角膜细胞和组织中的IL-1/-6/-8、TNF-α、ICAM-1等炎症相关因子表达明显高于正常人，提示圆锥角膜与慢性炎症密切相关[17]。本文研究发现，过氧化氢处理后圆锥角膜成纤维细胞炎性因子IL-1β/-6/-8和ICAM-1基因表达显著上调。在氧化应激状态下角膜上皮细胞也会释放IL-6[7].提示氧化应激可能是圆锥角膜炎性因子高表达的重要来源。
氧化应激导致组织降解。氧化应激可通过上调MMP-1、MMP-2、MMP-3及MMP-7的表达，参与皮肤损伤及结直肠癌等疾病的发展[18-19]，还可以通过调节MMPs/TIMPs参与动脉粥样硬化过程[20]。本研究发现，氧化应激可显著上调圆锥角膜成纤维细胞中MMP-1/-3的表达，同时下调TIMP-1/-2/-3的表达。BROWN et al[6]发现过亚硝酸盐或一氧化氮可降低人角膜成纤维细胞TIMP-1同时增加明胶酶活性，提示氧化应激与角膜组织之间降解存在一定关联。前期研究发现，TNF-α和IL-6可促进圆锥角膜成纤维细胞MMP-1的表达，IL-6抗体可明显抑制TNF-α诱导的MMP-1升高[21]；抑制IL-1可下调MMP-1/-3/-13表达，促进软骨修复[22]。说明炎性因子通过干扰基质金属蛋白酶与其抑制因子表达之间的平衡，参与了组织损伤修复和疾病病理过程。
Ⅰ型胶原是构成角膜基质的主要胶原蛋白，可通过LOXs交联形成稳定的网状结构，增强角膜组织力学特性和抗蛋白水解酶降解能力。前期研究发现，圆锥角膜患者角膜成纤维细胞中LOX和LOXLs基因表达均明显低于正常人[23]。本研究发现氧化应激可显著降低圆锥角膜细胞Collagen Ⅰ-α2、LOXL-1/-3/-4的表达，这将导致角膜组织结构稳定性下降。
本研究也存在一定的局限性。由于圆锥角膜发病的复杂性导致患者个体差异较大，大样本量可使研究结果更具参考价值，因此本文结果的解释还需谨慎。
综上所述，本研究发现氧化应激状态下，圆锥角膜成纤维细胞炎性因子表达增加，促进了MMPs与TIMPs表达失衡，LOXLs表达降低，导致Ⅰ型胶原降解增加，交联障碍。这不仅破坏了角膜结构的稳定性，而且使角膜组织抵抗非特异性蛋白水解酶能力下降，进而导致力学性能下降，加速角膜扩张。因此，避免圆锥角膜处于氧化应激状态，有效控制炎性因子的释放，有望减缓圆锥角膜的发展进程。
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